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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做蛋白体外表达时的引物设计问题！
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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 做蛋白体外表达时的引物设计问题！

1 ATCACTCCTC ACACCCTAAA CTCCCATTCT TACCAGCTCT CCTTCCATGG CTCGCTCCTC
     61 CGCCGTCTGC TTCCTCCTCC TCCTCGCCTT CCTCATTGGC ACAGCCTCGG CA(ATCACCTG
    121 TGGTCAGGTT GACTCTGACC TCACCTCCTG CCTTGGCTAT GCTAGAAAGG GCGGGGTCAT
    181 CCCACCGGGC TGCTGCGCGG GTGTGAGGAC CCTTAACAAC TTAGCCAAGA CCACTCCTGA
    241 TCGCCAGACT GCATGCAACT GCCTCAAGTC TCTGGTGAAC CCCAGCCTTG GCCTCAATGC
    301 TGCTATCGTC GCCGGCATCC CCGGCAAGTG CGGCGTCAAC ATCCCCTACC CGATCAGCAT
    361 GCAGACTGAT TGCAACAAGG TGAGGTAA)AT CTCCGTATGG AGCCTACTGC TGGTACTGCG
    421 CATCTGCTGG TTTTATTATT AGTACTACTT GGTCGGAGCG GCGGGAATAA AAGACGCTTC
    481 ATTCACCAAT GTTTGGTTTG TGAACCAGTT TGCGGTGTTG TAGTCTTCTG TTTCAGCTAA
    541 TGATGTTACA TTTTAGACTC TCATTATCTT CGATGGTGGG GTCTGTAGCA TTGTAATAAA
    601 ATTATGTTAT GTTATGAAAT TTGAGTTTTT TCCTTGGTAA AAAAAAAAAA
以上是cDNA序列，括号中的是表达成熟蛋白的序列，现在想做蛋白的体外表达，该怎么设计引物啊？是不是一定要在括号的两端设计啊？这样会很受局限的吧！
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1楼 2011-05-23 15:43:26
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friya0910

新虫 (正式写手)
自己顶一下，希望有高人指点啊！着急……
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2楼2011-05-23 15:44:11
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-05-23 20:17:58
friya0910(金币+1): 2011-05-25 09:28:24
设计引物是看你将表达蛋白的那段序列往什么表达载体上连接了。。。载体不同，当然酶切位点是不一样的。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-05-23 16:31:07
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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-05-23 20:18:04
friya0910(金币+2): 2011-05-25 09:28:19
貌似表达成熟蛋白的话，引物Binding部分你没别的选择吧？你在别的位置设计引物好像不能出来你的成熟蛋白吧。。。至于酶切位点，根据需要添加上即可。。
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海贼王！哥当定了。。。。
4楼2011-05-23 16:53:18
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-23 20:18:08
friya0910(金币+5): 2011-05-25 09:27:56
引物如下，
F：ATCACCTGTGGTCAGGTT GACTCT
R：TTACCTCACCTTGTTGCAATCAGTC
primer 5设计，
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5楼2011-05-23 17:29:54
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-23 16:31:07:
设计引物是看你将表达蛋白的那段序列往什么表达载体上连接了。。。载体不同，当然酶切位点是不一样的。。。

得先设计引物然后再在5‘端加酶切位点吧，我是想问我的引物是不是只能在括号两端设计啊？特别是上游引物是不是只能从ATC开始呢？在ATC前不能再放别的碱基了吧
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6楼2011-05-25 08:36:59
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

friya0910(金币+2): 2011-05-25 10:00:47
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-05-25 08:36:59:
得先设计引物然后再在5‘端加酶切位点吧，我是想问我的引物是不是只能在括号两端设计啊？特别是上游引物是不是只能从ATC开始呢？在ATC前不能再放别的碱基了吧

这个没多大关系的。。。。只要保证和载体上的酶切位点一致就可以了、、、
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7楼2011-05-25 09:02:18
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-25 09:02:18:
这个没多大关系的。。。。只要保证和载体上的酶切位点一致就可以了、、、

我的意思是不考虑酶切位点，我的引物是不是一定要从编码第一个氨基酸的ATC开始，因为老师给我设计的引物为了降低上游引物的CG含量，在ATC前面又加了个A，然后再加的酶切位点和保护碱基，我总觉得这样的话表达的蛋白会不会就不对了啊！请高人赐教！
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8楼2011-05-25 09:52:14
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-05-25 09:52:14:
我的意思是不考虑酶切位点，我的引物是不是一定要从编码第一个氨基酸的ATC开始，因为老师给我设计的引物为了降低上游引物的CG含量，在ATC前面又加了个A，然后再加的酶切位点和保护碱基，我总觉得这样的话表达的 ...

是ATG吧？老师给你设计的引物？那你可以问问你们老师呀。。。应该没有什么问题的。。
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9楼2011-05-25 12:11:54
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wuzuobin125

铜虫 (小有名气)
天使托已经说的很明白了，设计引物不一定非要从你给的序列的第一个碱基开始的，你可以在前面加上一些保护碱基或是酶切位点的，基因转录翻译的时候，氨基酸是不受你在前面加上去的碱基影响的，还是会从你给的序列的第一个氨基酸开始翻译的。你老师的设计就说明了设计引物可以在前进加上一些碱基的。
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10楼2011-05-25 16:38:13
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