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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 悬赏引物设计问题
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)

[求助] 悬赏引物设计问题

Forward primer :
5′-gCCggATCCTAgAAgAAATTTCTgCCATggT-3′
(BamH Ⅰ)

Reverse primer:
5′-GGCCGGCTCGAGTCCTCAGCAAACTTCTCAG-3′
(Xho Ⅰ )请问这两条引物设计的是否合适，能否形成发卡结构？

[ Last edited by tianhuijuan on 2011-9-21 at 12:52 ]
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1楼 2011-09-21 12:50:07
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hgq115

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助。 2011-09-21 18:39:43
tianhuijuan(金币+20): 2011-09-22 13:21:52
上游引物会出现发夹结构和自身二聚体，其中引物自身配对导致的二聚体比较严重。下游引物也会出现二聚体，不过关系不大，主要还是上游引物问题比较严重
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2楼2011-09-21 13:17:55
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hgq115 at 2011-09-21 13:17:55:
上游引物会出现发夹结构和自身二聚体，其中引物自身配对导致的二聚体比较严重。下游引物也会出现二聚体，不过关系不大，主要还是上游引物问题比较严重

多谢hgq115同学的帮助！由于初涉生物化学，特别是相关引物设计的软件不会应用，以上是手动设计的引物，现在能有PCR产物，就是接下来的酶切连接转化一直不成功，请问是不是和你说的引物设计不合适有关？另外还有上游引物的保护碱基3个可以吧，是不是一定要六个（以上） ？
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3楼2011-09-22 13:29:27
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hgq115

金虫 (小有名气)
★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 17:07:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by tianhuijuan at 2011-09-22 13:29:27:
多谢hgq115同学的帮助！由于初涉生物化学，特别是相关引物设计的软件不会应用，以上是手动设计的引物，现在能有PCR产物，就是接下来的酶切连接转化一直不成功，请问是不是和你说的引物设计不合适有关？另外还有上 ...

如果PCR能成功的话那说明引物应该是没问题的，后面的步骤需要你一步步去认证具体哪一步出现问题才能找到解决方案，如第一步的酶切是否将酶切位点切开，如果酶切不成功，那后面的肯定是做不了的，我以前用的酶切位点保护碱基是导师给的，后来发现百度上都能搜到，对照了下发现跟你的不同，不知道这个会不会影响你的实验：BamH1：CG或CGC，下游引物XhoI：CCG CTCGAG CGG
另外，我发现你的Reverse primer写的时候从5'—3'的，但PCR扩增的时候是3'—5'的，那么你的XhoI位点反过来后就不是XhoI位点了吧？ 因此你设计的时候应该写成GAGCTC吧？
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4楼2011-09-22 15:01:33
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moqiyilei

金虫 (小有名气)
★ ★
adslye(金币+2): 很仔细，鼓励~国庆快乐~ 2011-09-30 17:08:01
引用回帖:
4楼: Originally posted by hgq115 at 2011-09-22 15:01:33:
如果PCR能成功的话那说明引物应该是没问题的，后面的步骤需要你一步步去认证具体哪一步出现问题才能找到解决方案，如第一步的酶切是否将酶切位点切开，如果酶切不成功，那后面的肯定是做不了的，我以前用的酶切位 ...

4楼说的不全对吧，反向引物扩增的时候也是按5’-3’方向进行，所以不能把酶切位点变成互补碱基。
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tianhuijuan
5楼2011-09-22 15:57:06
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hgq115

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by moqiyilei at 2011-09-22 15:57:06:
4楼说的不全对吧，反向引物扩增的时候也是按5’-3’方向进行，所以不能把酶切位点变成互补碱基。

谢谢纠正，是我搞错了
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6楼2011-09-22 16:35:34
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hgq115 at 2011-09-22 15:01:33:
如果PCR能成功的话那说明引物应该是没问题的，后面的步骤需要你一步步去认证具体哪一步出现问题才能找到解决方案，如第一步的酶切是否将酶切位点切开，如果酶切不成功，那后面的肯定是做不了的，我以前用的酶切位 ...

你好，请问保护碱基不是随意加的吗，有时侯为了保证G+C含量，不是还有加A 和T的吗？还有你的意思是XhoI 酶切微点前后都要加保护碱基吗？我们一般都是加一边啊，另一端就是和目的片段互补的序列了。还请指点迷津，多谢！
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7楼2011-09-22 17:39:45
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by moqiyilei at 2011-09-22 15:57:06:
4楼说的不全对吧，反向引物扩增的时候也是按5’-3’方向进行，所以不能把酶切位点变成互补碱基。

8楼2011-09-22 17:40:45
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hgq115

金虫 (小有名气)
★ ★
adslye(金币+2): 鼓励鼓励~国庆快乐~ 2011-09-30 17:08:41
引用回帖:
7楼: Originally posted by tianhuijuan at 2011-09-22 17:39:45:
你好，请问保护碱基不是随意加的吗，有时侯为了保证G+C含量，不是还有加A 和T的吗？还有你的意思是XhoI 酶切微点前后都要加保护碱基吗？我们一般都是加一边啊，另一端就是和目的片段互补的序列了。还请指点迷津， ...

是的，保护碱基只加一边就行了，其实保护碱基就是要给限制性内切酶一个结合位点，3'端还有更长的引物序列在，当然不需要再加保护碱基了，我给的保护碱基是NEB公司提供的，你可以去看看：http://wenku.baidu.com/view/d025d1e819e8b8f67c1cb9a2.html
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9楼2011-09-23 08:57:07
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hgq115 at 2011-09-23 08:57:07:
是的，保护碱基只加一边就行了，其实保护碱基就是要给限制性内切酶一个结合位点，3'端还有更长的引物序列在，当然不需要再加保护碱基了，我给的保护碱基是NEB公司提供的，你可以去看看：[url]http://wenku.baidu ...

十分感谢！
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10楼2011-09-23 11:20:40
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