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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达引物设计的问题
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1楼 2012-02-19 11:33:43
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回帖置顶 ( 共有1个 )

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！辛苦哈~ 2012-02-19 18:48:56
facingworld(金币+10): ★★★很有帮助 谢谢你啦！ 2012-02-21 09:32:20
1、不用去掉TAA和ATG（注意：TAA不是终止子，是终止密码子，ATG，是起始密码子，概念要搞清楚！）。
2、pET-28a（+）用BamHl(198)和Xhol(158）位点不会造成移码突变的。
3、pET-28a（+）只有一个his-tag，不是你说的两个，pET-28b（+）才有两个his-tag。
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2楼2012-02-19 15:13:17
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匿名

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3楼2012-02-21 09:35:13
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-21 10:09:15
facingworld(金币+3): ★★★很有帮助 谢谢你啦！ 2012-02-21 14:47:01
pET-28a在t7启动子下游有自带的SD序列和ATG，你的片段带不带ATG没啥影响。至于纯化，2个组氨酸标签肯定更容易纯化。28a只有一个组氨酸标签。b有2个，你可以把你的OPF的TAA通过引物设计去掉，这样可以带上2个HIS。
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无善无恶心之体
4楼2012-02-21 10:01:10
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ding_winnie

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
facingworld(金币+3): ★★★很有帮助 谢谢了! 2012-02-21 14:48:32
如果要用his纯化，最好设计三个，一个在上游，一个在下游，还有上下游都有的，因为加入his可能会影响蛋白的折叠。。。这是我个人的理解。。。
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5楼2012-02-21 10:10:30
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by facingworld at 2012-02-21 09:35:13:
那如果是pET-28b(+)载体呢？还是这两个酶切位点，是不是会造成译码突变，需要加几个碱基，我打算用C端的His柱纯化，是不是要加起始密码子ATG？

pET-28b(+)也用这两个酶切位点会移码，要加一个碱基。
用C端的His-tag，跟起始密码子没有关系，删除终止密码子就好了，His-tag后面带了个终止密码子。
至于要不要加起始密码子ATG的问题，你的基因本身有的话就保留，没有的话也不用加，SD序列下游有起始密码子的。
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6楼2012-02-21 10:12:18
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447585565

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果你要两个his标签的话就去掉起始密码子和终止密码子，如果你只要C端的his标签的话，删掉终止密码子只保留起始密码子
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7楼2012-02-21 14:45:26
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