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weiminhb

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】关于绿色荧光蛋白表达问题

最近做绿色荧光蛋白的蛋白，将gfp基因转座到受体菌的基因组上，表达。证实gfp是插进去了的（有kan抗性筛选），第一次荧光显微镜检测是可以观察到荧光的，说明gfp表达了，但后来就观察不到了，怎么回事呢？是gfp表达不稳定吗?
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1楼 2010-11-17 09:48:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-11-17 12:06:45
首先是卡那和GFP是同等地转座到基因组上，还是说分成两段分别插的？
如果是后者，只能说是筛到了具有耐药性质的菌株

这种外源插进去的东西会让基因组不稳定，复制的时候会丢失，所以要挑单克隆
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5楼2010-11-17 12:04:33
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小乖小帅

铁虫 (小有名气)

同样问题

我的是转到细胞里，看到绿色荧光蛋白了，所以做了共聚焦，结果就没有看到蛋白表达，也不知道是怎么回事
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2楼2010-11-17 11:05:02
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lxblxb9

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 小乖小帅 at 2010-11-17 11:05:02:
我的是转到细胞里，看到绿色荧光蛋白了，所以做了共聚焦，结果就没有看到蛋白表达，也不知道是怎么回事

我更不知道是怎么回事，
我只想知道你们谁能给我绿色荧光蛋白基因
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3楼2010-11-17 11:24:08
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小乖小帅

铁虫 (小有名气)

等我问清楚了再告诉你啊

引用回帖:
Originally posted by lxblxb9 at 2010-11-17 11:24:08:

我更不知道是怎么回事，
我只想知道你们谁能给我绿色荧光蛋白基因

我直接做了转染和筛选，前面的是老师设计的，我还不是很清楚，等我问清楚了再告诉你啊
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4楼2010-11-17 11:53:20
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weiminhb

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-17 12:04:33:
首先是卡那和GFP是同等地转座到基因组上，还是说分成两段分别插的？
如果是后者，只能说是筛到了具有耐药性质的菌株

这种外源插进去的东西会让基因组不稳定，复制的时候会丢失，所以要挑单克隆

是一起插进去的。现在的问题是：将接合子在培养基中培养，培养基变绿了，但是取菌体荧光显微镜下观察，没有看到绿色荧光，而培养液变绿色了，现在准备做蛋白电泳，看看有没有GFP表达，有没有谁做过GFP表达的，GFP是胞内还是胞外的？
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6楼2010-11-30 15:03:56
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by weiminhb at 2010-11-30 15:03:56:

  
     是一起插进去的。现在的问题是：将接合子在培养基中培养，培养基变绿了，但是取菌体荧光显微镜下观察，没有看到绿色荧光，而培养液变绿色了，现在准备做蛋白电泳，看看有没有GFP表达，有没有谁做过GFP ...

是不是不小心在GFP加了个神马分泌的信号
另外有可能是你表达了毒蛋白，把宿主给杀了，所以……
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7楼2010-11-30 18:28:18
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damaomao

禁虫 (正式写手)
★
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8楼2012-04-24 11:12:58
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一点即通

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是有可能在传代过程中，绿色荧光蛋白基因从基因组中转座或是重组消失了？可以在不能检测到荧光的细胞中验证一下gfp基因的存在，仅供参考！
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9楼2012-04-24 14:00:54
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还有一个原因，就是荧光淬灭。所以也有文献报导说，要加一些固定剂的。记得丙酮是一个很不错的固定剂。
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10楼2012-05-11 20:32:17
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yili_90

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
将基因插入绿色荧光载体中，并转染进入293T细胞进行表达，48小时后观察细胞没有发现荧光，但重组载体测序正常，不知道什么原因
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11楼2014-03-24 22:39:41
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