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weiminhb

铁虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】关于绿色荧光蛋白表达问题

最近做绿色荧光蛋白的蛋白,将gfp基因转座到受体菌的基因组上,表达。证实gfp是插进去了的(有kan抗性筛选),第一次荧光显微镜检测是可以观察到荧光的,说明gfp表达了,但后来就观察不到了,怎么回事呢?是gfp表达不稳定吗?
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silicare(金币+1):谢谢参与 2010-11-17 12:06:45
首先是卡那和GFP是同等地转座到基因组上,还是说分成两段分别插的?
如果是后者,只能说是筛到了具有耐药性质的菌株

这种外源插进去的东西会让基因组不稳定,复制的时候会丢失,所以要挑单克隆
5楼2010-11-17 12:04:33
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普通回帖

小乖小帅

铁虫 (小有名气)


同样问题

我的是转到细胞里,看到绿色荧光蛋白了,所以做了共聚焦,结果就没有看到蛋白表达,也不知道是怎么回事
2楼2010-11-17 11:05:02
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lxblxb9

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 小乖小帅 at 2010-11-17 11:05:02:
我的是转到细胞里,看到绿色荧光蛋白了,所以做了共聚焦,结果就没有看到蛋白表达,也不知道是怎么回事

我更不知道是怎么回事,
我只想知道你们谁能给我绿色荧光蛋白基因
3楼2010-11-17 11:24:08
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小乖小帅

铁虫 (小有名气)


等我问清楚了再告诉你啊

引用回帖:
Originally posted by lxblxb9 at 2010-11-17 11:24:08:

我更不知道是怎么回事,
我只想知道你们谁能给我绿色荧光蛋白基因

我直接做了转染和筛选,前面的是老师设计的,我还不是很清楚,等我问清楚了再告诉你啊
4楼2010-11-17 11:53:20
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weiminhb

铁虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-17 12:04:33:
首先是卡那和GFP是同等地转座到基因组上,还是说分成两段分别插的?
如果是后者,只能说是筛到了具有耐药性质的菌株

这种外源插进去的东西会让基因组不稳定,复制的时候会丢失,所以要挑单克隆

是一起插进去的。现在的问题是:将接合子在培养基中培养,培养基变绿了,但是取菌体荧光显微镜下观察,没有看到绿色荧光,而培养液变绿色了,现在准备做蛋白电泳,看看有没有GFP表达,有没有谁做过GFP表达的,GFP是胞内还是胞外的?
6楼2010-11-30 15:03:56
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引用回帖:
Originally posted by weiminhb at 2010-11-30 15:03:56:

  
     是一起插进去的。现在的问题是:将接合子在培养基中培养,培养基变绿了,但是取菌体荧光显微镜下观察,没有看到绿色荧光,而培养液变绿色了,现在准备做蛋白电泳,看看有没有GFP表达,有没有谁做过GFP ...

是不是不小心在GFP加了个神马分泌的信号
另外有可能是你表达了毒蛋白,把宿主给杀了,所以……
7楼2010-11-30 18:28:18
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damaomao

禁虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

8楼2012-04-24 11:12:58
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一点即通

铁虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
是不是有可能在传代过程中,绿色荧光蛋白基因从基因组中转座或是重组消失了?可以在不能检测到荧光的细胞中验证一下gfp基因的存在,仅供参考!
9楼2012-04-24 14:00:54
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emma立夏

铁虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
还有一个原因,就是荧光淬灭。所以也有文献报导说,要加一些固定剂的。记得丙酮是一个很不错的固定剂。
10楼2012-05-11 20:32:17
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yili_90

金虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
将基因插入绿色荧光载体中,并转染进入293T细胞进行表达,48小时后观察细胞没有发现荧光,但重组载体测序正常,不知道什么原因
11楼2014-03-24 22:39:41
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