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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白诱导问题咨询
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zhy19850501

[交流] 【求助/交流】蛋白诱导问题咨询 已有10人参与

大家好，最近做蛋白诱导遇到一些问题，Western blot 检测有目的蛋白表达，但SDS-PAGE检测则看不到明显的目的条带，已经多次优化条件，但没有效果，希望大家多多帮忙，谢谢！
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1楼 2010-05-05 20:19:32
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todouhy

铜虫 (小有名气)
★
plantaqp(金币+1):谢谢交流 2010-05-06 03:22:18
会不会是形成了包涵体的啊？
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2楼2010-05-05 21:32:53
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
plantaqp(金币+1): 2010-05-06 03:22:41
引用回帖:
Originally posted by zhy19850501 at 2010-05-05 20:19:32:
大家好，最近做蛋白诱导遇到一些问题，Western blot 检测有目的蛋白表达，但SDS-PAGE检测则看不到明显的目的条带，已经多次优化条件，但没有效果，希望大家多多帮忙，谢谢！

我也遇到这个问题，换了3种表达载体和2种不同的表达菌株，试过17，25，30，37度条件，加的IPTG终浓度包括有0.1，0.4和1mM。但是都没有很明显的目的条带。只是没有做western来检测。现在也在苦恼怎么在大肠中表达植物基因了。


希望能一起交流！
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3楼2010-05-05 21:41:21
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★
plantaqp(金币+1):谢谢交流 2010-05-06 03:23:04
引用回帖:
Originally posted by todouhy at 2010-05-05 21:32:53:
会不会是形成了包涵体的啊？

和楼主遇到了同样的问题，同时试过了超声波裂解后的上清及沉淀的重悬产物的检测，与对照相比也没有明显差异的蛋白条带。

[ Last edited by dfl204 on 2010-5-5 at 21:44 ]
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4楼2010-05-05 21:42:31
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段家一凡

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
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plantaqp(金币+2):谢谢交流 2010-05-06 03:23:24
换表达菌株，真核原核的都试试，还有含稀有密码子的表达菌株也试试。
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5楼2010-05-06 00:00:16
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★ ★ ★ ★ ★ ★
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plantaqp(金币+5):谢谢交流 2010-05-06 03:23:36
还应该分析一下你的基因，是不是有穿膜结构，定位在膜上了，如果是这样就麻烦了。我有个蛋白表达也是换了3种菌株，因为一开始以为是稀有密码子含量有6%，以为是这个原因，换了+RIL的也不见好。温度时间IPTG浓度之类的也换个好多条件。用SDSPAGE就是检测不出来
后来分析了序列竟然有7个跨膜区域，觉得有可能在膜上，超声破碎后离心，取沉淀煮煮上样，western blot检测，有非常特异性的带。大小也对，估计就是我要的蛋白了。
现在还不知道后续怎么去纯化好，纯化膜蛋白就我在的实验室平台来说还有些困难，先放着不甩了
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终于熬成木虫了……
6楼2010-05-06 01:47:23
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zhy19850501

谢谢大家的帮忙，我诱导的蛋白本身就是膜蛋白，不过在大肠杆菌中诱导时它还会在膜上吗？要正如楼上说的那样，那应该怎么解决这个问题？谢谢！
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7楼2010-05-06 10:23:27
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20091357

无虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
лллл
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8楼2010-05-06 10:25:42
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zjzz at 2010-05-06 01:47:23:
还应该分析一下你的基因，是不是有穿膜结构，定位在膜上了，如果是这样就麻烦了。我有个蛋白表达也是换了3种菌株，因为一开始以为是稀有密码子含量有6%，以为是这个原因，换了+RIL的也不见好。温度时间IPTG浓度之 ...

推荐你读一篇文献：
Effective high throughput overproduction of membrane proteins in E.coli
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
9楼2010-05-06 11:22:22
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
膜蛋白用一般的诱导条件可能很难诱导出来，你可以读下上面那篇文献和以下文献：
Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures
T7表达系统及自诱导蛋白产出策略

我用该系统做过不少蛋白，不少是IPTG诱导不出来的换这个培养条件可以诱导出来，而且高表达。有问题可以交流。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
10楼2010-05-06 11:25:05
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