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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 原核表达蛋白诱导不出来
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yalan_p

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达蛋白诱导不出来

最近用pGEX-4T-1构建了一个融合蛋白的表达载体，测序结果显示没有出现碱基的位移和变异，但是做诱导的时候却一直没有目的蛋白，我的蛋白在23kD左右，GST标签为26kD，诱导后在50kD左右应有比较亮的条带，但是SDS电泳显示30摄氏度诱导4h后的蛋白表达与对照是一样的。上清和沉淀都分别做了电泳，都是一样的结果。
    请教高手，这种情况我该怎么办？可能是什么原因？该如何进一步优化条件？
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1楼 2011-10-26 18:17:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

狄志欣dzx

新虫 (初入文坛)
一般在构建质粒时可以根据密码子的偏好性做一定的改变。我们实验室的师姐设计基因时根据氨基酸序列反转录出DNA，只不过要改一下密码子，这就要根据表达菌种改变。
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15楼2013-09-18 10:30:11
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ft610313217

新虫 (初入文坛)
我现在也遇到类似的问题，我用的是pGEX-4T-2，交给公司构建的质粒，拿回来直接诱导表达，表达不出蛋白，请问你最后是怎么解决的，期待回复
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16楼2015-07-18 09:10:08
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普通回帖

yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

yalan_p(金币+1): 唉，基本原理我也明白，现在已经做过了IPTG0.1mmol到1mmol，时间从3到5小时，就是诱导温度还没有改，之前一直是30度诱导 2011-10-26 21:55:17
不同的诱导时间点，
不同的诱导剂量，
不同的诱导温度
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2楼2011-10-26 20:19:33
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★
adslye(金币+2): 很好的建议！鼓励交流~~ 2011-10-27 09:26:31
我估计换16度和25度也不会有什么表达。

分析下是不是有稀有密码子，换宿主吧。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-10-27 00:04:52
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sl35537417

木虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by yalan_p at 2011-10-26 18:17:26:
最近用pGEX-4T-1构建了一个融合蛋白的表达载体，测序结果显示没有出现碱基的位移和变异，但是做诱导的时候却一直没有目的蛋白，我的蛋白在23kD左右，GST标签为26kD，诱导后在50kD左右应有比较亮的条带，但是SDS电 ...

更换载体或者宿主
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4楼2011-10-27 09:05:05
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-10-27 00:04:52:
我估计换16度和25度也不会有什么表达。

分析下是不是有稀有密码子，换宿主吧。

同意
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我选择，我喜欢；我喜欢我的选择。
5楼2011-10-27 09:29:01
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香凝冷星

银虫 (小有名气)
我也有同样的困惑，伤不起啊。。。。。。。。。。。。。
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6楼2011-10-27 09:49:32
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547star

木虫 (著名写手)
买个GST抗体做WB吧。
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为什么
7楼2011-10-27 18:03:39
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yalan_p

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-10-27 00:04:52:
我估计换16度和25度也不会有什么表达。

分析下是不是有稀有密码子，换宿主吧。

请问一下怎么分析是不是稀有密码子？
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8楼2011-10-28 00:08:42
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yalan_p

银虫 (小有名气)
另外，我现在用的是BL21，换宿主的话换什么呢？
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9楼2011-10-28 00:09:10
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imfly77

木虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by yalan_p at 2011-10-26 18:17:26:
最近用pGEX-4T-1构建了一个融合蛋白的表达载体，测序结果显示没有出现碱基的位移和变异，但是做诱导的时候却一直没有目的蛋白，我的蛋白在23kD左右，GST标签为26kD，诱导后在50kD左右应有比较亮的条带，但是SDS电 ...

(1) 把你的全蛋白SDS图谱贴一下。
(2) 要不试试BL21(DE3)，载体换成pET30a？这样可以提高表达量。
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10楼2011-10-28 08:40:27
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