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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 原核表达蛋白诱导不出来
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yalan_p

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达蛋白诱导不出来

最近用pGEX-4T-1构建了一个融合蛋白的表达载体，测序结果显示没有出现碱基的位移和变异，但是做诱导的时候却一直没有目的蛋白，我的蛋白在23kD左右，GST标签为26kD，诱导后在50kD左右应有比较亮的条带，但是SDS电泳显示30摄氏度诱导4h后的蛋白表达与对照是一样的。上清和沉淀都分别做了电泳，都是一样的结果。
    请教高手，这种情况我该怎么办？可能是什么原因？该如何进一步优化条件？
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1楼 2011-10-26 18:17:26
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imfly77

木虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by yalan_p at 2011-10-26 18:17:26:
最近用pGEX-4T-1构建了一个融合蛋白的表达载体，测序结果显示没有出现碱基的位移和变异，但是做诱导的时候却一直没有目的蛋白，我的蛋白在23kD左右，GST标签为26kD，诱导后在50kD左右应有比较亮的条带，但是SDS电 ...

(1) 把你的全蛋白SDS图谱贴一下。
(2) 要不试试BL21(DE3)，载体换成pET30a？这样可以提高表达量。
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10楼2011-10-28 08:40:27
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

yalan_p(金币+1): 唉，基本原理我也明白，现在已经做过了IPTG0.1mmol到1mmol，时间从3到5小时，就是诱导温度还没有改，之前一直是30度诱导 2011-10-26 21:55:17
不同的诱导时间点，
不同的诱导剂量，
不同的诱导温度
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2楼2011-10-26 20:19:33
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★
adslye(金币+2): 很好的建议！鼓励交流~~ 2011-10-27 09:26:31
我估计换16度和25度也不会有什么表达。

分析下是不是有稀有密码子，换宿主吧。
赞一下(1人) 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-10-27 00:04:52
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sl35537417

木虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by yalan_p at 2011-10-26 18:17:26:
最近用pGEX-4T-1构建了一个融合蛋白的表达载体，测序结果显示没有出现碱基的位移和变异，但是做诱导的时候却一直没有目的蛋白，我的蛋白在23kD左右，GST标签为26kD，诱导后在50kD左右应有比较亮的条带，但是SDS电 ...

更换载体或者宿主
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4楼2011-10-27 09:05:05
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