| 查看: 3699 | 回复: 41 | |||
maggie3277木虫 (小有名气)
|
[交流]
【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带已有22人参与
|
||
| 请教各位虫友，最近做重组蛋白的表达。但在大肠杆菌内重组的pet28a总表达不出我的目标条带，IPTG诱导浓度也设置了梯度，温度也设定了梯度。但就是没有我的目标条带的生成。请问有虫友遇到过类似情况，构建好的质粒却表达不出条带的情况吗？ |
回复此楼» 猜你喜欢
球磨分散剂
已经有4人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有63人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
-
土壤中可溶性有机碳种类
已经有1人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 蛋白诱导不能表达！
已经有21人回复
- IPTG诱导后，考染后什么蛋白条带都没有
已经有12人回复
- 原核表达蛋白诱导不出来
已经有16人回复
- 怎么提高诱导表达的目的蛋白含量
已经有14人回复
- IPTG诱导蛋白的SDS-PAGE图中奇怪的现象请教！
已经有30人回复
- 渗透冲击法 裂解诱导后的E.coli BL21(DE3)，提纯HIS-tag蛋白，求指导
已经有12人回复
- 外源蛋白诱导表达量特别少，求大侠解惑
已经有10人回复
- 【求助/交流】基因工程菌诱导蛋白表达的问题
已经有14人回复
- 【求助/交流】蛋白酶在大肠杆菌表达在牛奶平板上有透明圈，液体诱导却无酶活
已经有5人回复
- 【求助/交流】诱导pkd46质粒表达不出目的蛋白
已经有12人回复
- 【求助/交流】蛋白诱导问题咨询
已经有13人回复
- 【分享】个人整理 Western Blot(转）
已经有73人回复
- 蛋白诱导
已经有10人回复
5楼2010-07-24 09:11:43
月月大可
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 3272.1
- 散金: 1393
- 红花: 17
- 帖子: 1674
- 在线: 295.7小时
- 虫号: 549127
- 注册: 2008-04-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:23
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:23
|
pET28a我正在是用，给出几点建议，LZ可以尝试一下： 1、对表达载体再次测序，确定整个ORF的正确性（要从载体最前端含有标签的起始位置到终止子部分）。确定载体没有问题（其他基因使用时候可以表达）； 2、441个氨基酸中有37个稀有密码子也无需大惊小怪，关键问题是只要没有两个或者三个以上稀有密码子串联出现。如果担心稀有密码子问题可以考虑使用Rosetta菌柱系列； 3、建议试诱导的条件为37℃ 1mM IPTG诱导4h。分别取诱导前和诱导后个200微升，加入40微升Loading buffer ，上样前高速离心10min。上样16-18微升，对比诱导前后有没有明显的差异条带； 4、如果上述步骤没有看到明显的差异条带，而测序显示阅读框没有任何问题，建议扩大培养。一次培养200ml-1L的菌液，使用亲和柱富集。然后从柱子上洗脱，看有没有目的蛋白。有时候表达量第，需要富集后才能看到有目的蛋白的表达。 还不行就尝试更换载体。 |
33楼2010-08-04 18:52:54
小白3521
金虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 690.8
- 散金: 218
- 帖子: 251
- 在线: 73.8小时
- 虫号: 769519
- 注册: 2009-05-13
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2010-07-23 23:28:47
lwiaanngg
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 贵宾: 0.773
- 金币: 7402.7
- 散金: 24
- 红花: 12
- 帖子: 1211
- 在线: 110.3小时
- 虫号: 43541
- 注册: 2004-04-10
- 专业: 应用高分子化学与物理
3楼2010-07-24 00:11:56
sunyongle1
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2644.8
- 散金: 1
- 帖子: 412
- 在线: 103.4小时
- 虫号: 1059232
- 注册: 2010-07-17
- 专业: 肿瘤发生
4楼2010-07-24 08:04:55
maggie3277
木虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2414.7
- 帖子: 154
- 在线: 47.1小时
- 虫号: 574576
- 注册: 2008-06-16
- 性别: MM
- 专业: 细胞生物学
6楼2010-07-24 12:48:37
maggie3277
木虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2414.7
- 帖子: 154
- 在线: 47.1小时
- 虫号: 574576
- 注册: 2008-06-16
- 性别: MM
- 专业: 细胞生物学
7楼2010-07-24 12:50:08
maggie3277
木虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2414.7
- 帖子: 154
- 在线: 47.1小时
- 虫号: 574576
- 注册: 2008-06-16
- 性别: MM
- 专业: 细胞生物学
8楼2010-07-24 12:52:45
maggie3277
木虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2414.7
- 帖子: 154
- 在线: 47.1小时
- 虫号: 574576
- 注册: 2008-06-16
- 性别: MM
- 专业: 细胞生物学
9楼2010-07-24 12:55:27
lwiaanngg
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 贵宾: 0.773
- 金币: 7402.7
- 散金: 24
- 红花: 12
- 帖子: 1211
- 在线: 110.3小时
- 虫号: 43541
- 注册: 2004-04-10
- 专业: 应用高分子化学与物理
10楼2010-07-24 12:57:02
50