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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带
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maggie3277

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带 已有22人参与

请教各位虫友，最近做重组蛋白的表达。但在大肠杆菌内重组的pet28a总表达不出我的目标条带，IPTG诱导浓度也设置了梯度，温度也设定了梯度。但就是没有我的目标条带的生成。请问有虫友遇到过类似情况，构建好的质粒却表达不出条带的情况吗？
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1楼 2010-07-23 22:04:49
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louli

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-24 13:23:28
我之前在大肠杆菌中表达也是，但是后来发现诱导时间不够，一般大家都诱导5个小时，而我的得诱导7-10个，后来查文献有的还过夜诱导的。你试试延长诱导时间吧！
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5楼2010-07-24 09:11:43
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:23
pET28a我正在是用，给出几点建议，LZ可以尝试一下：
1、对表达载体再次测序，确定整个ORF的正确性（要从载体最前端含有标签的起始位置到终止子部分）。确定载体没有问题（其他基因使用时候可以表达）；
2、441个氨基酸中有37个稀有密码子也无需大惊小怪，关键问题是只要没有两个或者三个以上稀有密码子串联出现。如果担心稀有密码子问题可以考虑使用Rosetta菌柱系列；
3、建议试诱导的条件为37℃ 1mM IPTG诱导4h。分别取诱导前和诱导后个200微升，加入40微升Loading buffer ，上样前高速离心10min。上样16-18微升，对比诱导前后有没有明显的差异条带；
4、如果上述步骤没有看到明显的差异条带，而测序显示阅读框没有任何问题，建议扩大培养。一次培养200ml-1L的菌液，使用亲和柱富集。然后从柱子上洗脱，看有没有目的蛋白。有时候表达量第，需要富集后才能看到有目的蛋白的表达。
    还不行就尝试更换载体。
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33楼2010-08-04 18:52:54
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小白3521

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-23 23:53:32
测序正确吗？或者换一种表达菌株试一试看
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2楼2010-07-23 23:28:47
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-07-24 06:18:43
LS说的对，你测序结果好么？
我一直不太喜欢28，更喜欢30点，呵呵
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3楼2010-07-24 00:11:56
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sunyongle1

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):感谢分享经验~~ 2010-07-24 12:45:46
我也遇到过一次，而且片段不是很长的那种。原来我用全长序列倒是表达出来了，只是量很低。后来就用了部分片段，没想到，就没有了。也不知道什么原因。
建议：首先保证测序正确（其实只要不发生移码突变之类，也应该表达出来啊）；你的序列是不是有稀有密码子；你的序列疏水区，信号肽，跨膜域这些都会影响表达；蛋白很大的话，也会影响它的表达。
不知道楼主是用来干什么呢？制备抗原，分析酶活？
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4楼2010-07-24 08:04:55
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maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 小白3521 at 2010-07-23 23:28:47:
测序正确吗？或者换一种表达菌株试一试看

是先连接到T载体上的，T载体是测过序的，现在连表达载体就直接酶切连接，还没有测序。应该不会还有什么问题吧。
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6楼2010-07-24 12:48:37
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maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-07-24 00:11:56:
LS说的对，你测序结果好么？
我一直不太喜欢28，更喜欢30点，呵呵

28a是我们实验室直接有的，就这么用着了，这个质粒本身就不太好用？
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7楼2010-07-24 12:50:08
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maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sunyongle1 at 2010-07-24 08:04:55:
我也遇到过一次，而且片段不是很长的那种。原来我用全长序列倒是表达出来了，只是量很低。后来就用了部分片段，没想到，就没有了。也不知道什么原因。
建议：首先保证测序正确（其实只要不发生移码突变之类，也应 ...

我是用Signal P预测的，然后将序列的信号肽去除连接上表达载体的，这个会影响蛋白的表达嘛？
我就是表达个蛋白测酶活的，蛋白也不是很大的。

[ Last edited by maggie3277 on 2010-7-24 at 12:54 ]
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8楼2010-07-24 12:52:45
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maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by louli at 2010-07-24 09:11:43:
我之前在大肠杆菌中表达也是，但是后来发现诱导时间不够，一般大家都诱导5个小时，而我的得诱导7-10个，后来查文献有的还过夜诱导的。你试试延长诱导时间吧！

我诱导20个小时，都是啥都没有哇！会不会长时间蛋白被体内的蛋白酶降解了？
不然缩短时间试试？嗯……
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9楼2010-07-24 12:55:27
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by maggie3277 at 2010-07-24 12:50:08:


28a是我们实验室直接有的，就这么用着了，这个质粒本身就不太好用？

我个人和我的一些朋友都感觉不是很好用了
不过这个你不要太在意，每个人的感觉不同，呵呵
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10楼2010-07-24 12:57:02
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