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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 渗透冲击法 裂解诱导后的E.coli BL21(DE3)，提纯HIS-tag蛋白，求指导
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nmgdwg

银虫 (小有名气)

[交流] 渗透冲击法 裂解诱导后的E.coli BL21(DE3)，提纯HIS-tag蛋白，求指导

最近在做220KD His-tag蛋白，最近试了下渗透冲击法提蛋白，用高渗40%（W/V）蔗糖处理后，再进行低渗处理，离心，菌体已经烂成一滩泥了！用30%（W/V）硫酸铵盐析后，没获得多少蛋白。第一次做，效果很不理想，求用过渗透冲击法的高手指导。十分感谢！！！

[ Last edited by nmgdwg on 2011-7-5 at 14:41 ]
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1楼 2011-07-05 14:39:55
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zsy1106

金虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+3): 感谢参与 2011-07-13 19:32:36
1、没获得多少蛋白的原因，恐怕不是因为你的渗透冲击法，而是本身就没表达出多少可溶状态（也就是说上清表达）的蛋白。
2、因为220KD有点超过大肠杆菌的表达能力了。即使有表达，大多也会以包涵体的形式存在。而以包涵体存在的蛋白在离心的时候已经和破碎的菌体一起存在在沉淀里了。
做这个蛋白，难度在于表达，而不是怎么裂解纯化。
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2楼2011-07-05 21:35:18
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-07-05 21:35:18:
1、没获得多少蛋白的原因，恐怕不是因为你的渗透冲击法，而是本身就没表达出多少可溶状态（也就是说上清表达）的蛋白。
2、因为220KD有点超过大肠杆菌的表达能力了。即使有表达，大多也会以包涵体的形式存在。而 ...

它是二聚体，单个亚基110KD 也很难？
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3楼2011-07-06 10:20:39
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zsy1106

金虫 (小有名气)
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nmgdwg(金币+5): 2011-07-08 13:16:10
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-07-13 19:32:51
引用回帖:
Originally posted by nmgdwg at 2011-07-06 10:20:39:
它是二聚体，单个亚基110KD 也很难？

110KD对于BL21而言，是可以表达的，但是表达量不会大，可能会有小部分表达在上清，但大部分可能是以不溶的包涵体形式存在，这个不一定，也要看你蛋白本身的性质，不知道楼主有没有拿序列去分析一下蛋白的亲疏水区域，如果亲水区域高的话，表达上清会稍稍容易一点。
楼主的蛋白是要拿来做什么的，包涵体复性的方法不知道能不能用
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4楼2011-07-06 11:19:18
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-07-06 11:19:18:
110KD对于BL21而言，是可以表达的，但是表达量不会大，可能会有小部分表达在上清，但大部分可能是以不溶的包涵体形式存在，这个不一定，也要看你蛋白本身的性质，不知道楼主有没有拿序列去分析一下蛋白的亲疏水 ...

都没做过，之前师姐在国外完成了这个试验，也不知道是她做的，还是老外做的，她带回来一个实验方案，老板让我先重复他的工作.....很头大
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5楼2011-07-08 13:18:34
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101202139

铜虫 (小有名气)
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lstt09nk(金币+3): 热心虫友，欢迎常来 2011-07-13 19:33:23
silicare(EPI+1): 2011-07-18 12:16:51
首先第一个问题：看看有没有其它的破碎细胞的方法，渗透冲击法我没有用过，但你可以尝试，高压破碎法，超声波破碎法，反复冻融法。
第二个问题：检测一下你的蛋白的可溶性
从上面几种破碎细胞的方法中选择一种效果较好的，跑SDS-PAGE（包括总蛋白，可溶性蛋白，沉淀重悬浮）来检测一下你的目的蛋白的可溶性。
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6楼2011-07-08 15:40:23
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 101202139 at 2011-07-08 15:40:23:
首先第一个问题：看看有没有其它的破碎细胞的方法，渗透冲击法我没有用过，但你可以尝试，高压破碎法，超声波破碎法，反复冻融法。
第二个问题：检测一下你的蛋白的可溶性
从上面几种破碎细胞的方法中选择一种效 ...

实验室有高压，以前没用过，请问高压时的buffer怎么配啊，我是小白，求高手指教
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7楼2011-07-11 11:51:01
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101202139

铜虫 (小有名气)
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Originally posted by nmgdwg at 2011-07-11 11:51:01:
实验室有高压，以前没用过，请问高压时的buffer怎么配啊，我是小白，求高手指教

高压破碎我也没用过，我的菌体量较少，一般用超声破碎！
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8楼2011-07-11 13:20:19
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
那超声用什么BUFFER呢？
我这每次培养只能收集到5g左右的菌体，还得攒到20g才能 进高压，郁闷啊！
当初老师怎么就买了高压啊啊  啊啊啊，超声多方便啊
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9楼2011-07-13 09:03:07
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 101202139 at 2011-07-11 13:20:19:
高压破碎我也没用过，我的菌体量较少，一般用超声破碎！

那超声用什么BUFFER呢？
我这每次培养只能收集到5g左右的菌体，还得攒到20g才能 进高压，郁闷啊！
当初老师怎么就买了高压啊啊  啊啊啊，超声多方便啊
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10楼2011-07-13 09:03:27
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101202139

铜虫 (小有名气)
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引用回帖:
Originally posted by nmgdwg at 2011-07-13 09:03:27:
那超声用什么BUFFER呢？
我这每次培养只能收集到5g左右的菌体，还得攒到20g才能 进高压，郁闷啊！
当初老师怎么就买了高压啊啊  啊啊啊，超声多方便啊

就用一般的缓冲液，含有tris-Hcl，EDTA，其实也可以用无菌水代替
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11楼2011-07-15 16:40:27
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nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 101202139 at 2011-07-15 16:40:27:
就用一般的缓冲液，含有tris-Hcl，EDTA，其实也可以用无菌水代替

DTT,β-ME的 神马的都不需要吗？
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12楼2011-07-18 12:09:51
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101202139

铜虫 (小有名气)
★
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Originally posted by nmgdwg at 2011-07-18 12:09:51:
DTT,β-ME的 神马的都不需要吗？

这个我认为不需要加，巯基乙醇我们只是用在洗涤缓冲液中，DTT不可以用，因为对镍树脂有负作用，至于是什么原因我就不清楚了。
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13楼2011-07-18 15:42:46
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