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viki_MDK

银虫 (正式写手)

[求助] 蛋白诱导不能表达！

我构建的pet-28a重组载体，测序后序列正确，但是我叫IPTG诱导12小时。20度后却没有发现目的大小的条带，请问这是什么原因？
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1楼 2012-03-20 19:32:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

whb21

木虫 (著名写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by viki_MDK at 2012-03-23 13:52:46:
超声破碎的的，稀释多少倍呢，会不会浓度太低，不好检测？

稀释倍数看菌浓，可以做几个梯度的稀释，要是都没有条带的话很可能是载体构建的问题了，PS：最好做一个空载的空白对照
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20楼2012-03-23 15:58:45
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thouder2010

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先，应该通过小瓶发酵，来确定发酵时间及IPTG的浓度是否合适，然后再做大瓶发酵，
还有是否你的表达蛋白形成了包涵体，
或者菌株不合适，可以换其他的表达菌株来做一下。
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21楼2012-03-23 16:01:27
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普通回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
温度是不是太低？菌长了吗？IPTG浓度多少？
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

viki_MDK
jiayoubashaonian
2楼2012-03-20 20:22:11
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-03-20 20:22:11:
温度是不是太低？菌长了吗？IPTG浓度多少？

菌体长的还是挺多的，IPTG浓度为1mM。
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3楼2012-03-20 20:43:05
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xiangyunch

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是目标基因片段过大，导致表达量改变较小？还有可以设下时间梯度试试
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4楼2012-03-21 09:23:43
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, Good! 2012-03-21 18:55:33
viki_MDK: 金币+5 2012-05-25 18:43:11
1 每种蛋白最佳表达的温度不一样的，有的低至15度左右，有的需要30度左右，你可以做下温度梯度看看。
2 处理过程中没有让蛋白降解吧？否则在预期大小处也可能看不到条带。
3 IPTG一般是在菌体OD值达到0.6-1 左右的时候加入。
4 你的宿主菌是适合目的蛋白表达的吗？
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5楼2012-03-21 10:12:58
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-03-21 10:12:58:
1 每种蛋白最佳表达的温度不一样的，有的低至15度左右，有的需要30度左右，你可以做下温度梯度看看。
2 处理过程中没有让蛋白降解吧？否则在预期大小处也可能看不到条带。
3 IPTG一般是在菌体OD值达到0.6-1 左右 ...

谢谢，我的蛋白对菌株生长是有抑制的，但是我培养后，菌体浓度还是挺高的。
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6楼2012-03-21 11:52:12
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiangyunch at 2012-03-21 09:23:43:
是不是目标基因片段过大，导致表达量改变较小？还有可以设下时间梯度试试

我的目的片段大小400bp不到，应该是比较小的了。
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7楼2012-03-21 11:52:49
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by viki_MDK at 2012-03-21 11:52:12:
谢谢，我的蛋白对菌株生长是有抑制的，但是我培养后，菌体浓度还是挺高的。

有抑制的话需要培养较长时间才能得到较浓的菌液和较高的表达量，你的菌没有被污染或者摇菌的菌是阳性转化菌吧？
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8楼2012-03-21 12:30:22
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zh10008100

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流！欢迎常来！ 2012-03-21 18:55:49
几种可能：1 该蛋白合成时候需要不是大肠杆菌的常用密码子，导致表达量过低。
                2蛋白带有信号肽，合成分泌至细胞外了
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9楼2012-03-21 15:42:42
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zh10008100 at 2012-03-21 15:42:42:
几种可能：1 该蛋白合成时候需要不是大肠杆菌的常用密码子，导致表达量过低。
                2蛋白带有信号肽，合成分泌至细胞外了

我做的克隆，信号肽以去除，并且细胞破碎后，上清和沉淀中都没检测到目的大小的蛋白。
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10楼2012-03-21 15:55:20
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