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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白表达，大肠杆菌总是死。。。
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zhyzx

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】蛋白表达，大肠杆菌总是死。。。

如题，我们是按照一般的蛋白表达的方法，将含有目的基因的重组质粒转化到表达菌株BL21中，用IPTG诱导表达。最近总是出现细菌摇着摇着总是死的情况，不管是IPTG诱导前后都有发生，不知道大家有没有遇到过这种情况啊？欢迎多多交流！
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1楼 2011-04-09 13:46:51
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
会不会是噬菌体污染？
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2楼2011-04-09 13:59:54
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zhyzx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-09 13:59:54:
会不会是噬菌体污染？

应该不是，因为每次并不是说每瓶都死，有的还是好好的能用的。而且整个实验室好几个人在做蛋白，每个人都出现过这种情况。
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3楼2011-04-09 14:12:41
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-04-09 18:13:48
表达的蛋白对细菌细胞本身有毒性作用
需要更温和的条件诱导以及更长的诱导时间

很难做
祝你好运
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4楼2011-04-09 15:49:13
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zhyzx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-04-09 15:49:13:
表达的蛋白对细菌细胞本身有毒性作用
需要更温和的条件诱导以及更长的诱导时间

很难做
祝你好运

谢谢！

现在的问题是在诱导之前就出现这种情况，本来长得还好好的，再过一会就看到菌液清了。

急死了
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5楼2011-04-09 15:51:07
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
zhyzx(金币+1): 2011-04-09 17:43:52
1949stone(EPI+1): 看来只有epi了 2011-04-09 18:14:11
哦
看叙述
还有其他人也出现这种情况
并且大家的都出现有的能用有的不能用
那就不是载体的问题了
应该是细胞本身的问题了
在找找所有不能使用的瓶子度满足什么不利情况
还有不同人的不能使用的组满足什么共同情况
祝你早早找到
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6楼2011-04-09 15:57:45
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 有道理。 2011-04-10 09:32:25
先看看你的表达蛋白是不是致死的哦？
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7楼2011-04-09 16:01:38
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zhyzx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jhu132llh at 2011-04-09 15:57:45:
哦
看叙述
还有其他人也出现这种情况
并且大家的都出现有的能用有的不能用
那就不是载体的问题了
应该是细胞本身的问题了
在找找所有不能使用的瓶子度满足什么不利情况
还有不同人的不能使用的组满足什么共 ...

我们目前能想到的原因就是BL21感受态的问题，可是这个源头是从公司买的，也许公司做的感受态本身就有问题，再考虑要不要换家公司的感受态或表达菌株。

谢谢你！
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8楼2011-04-09 16:50:53
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zhyzx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xujian568 at 2011-04-09 16:01:38:
先看看你的表达蛋白是不是致死的哦？

应该不是，因为我们有好多蛋白在表达，而且之前我也提纯过一些这个蛋白
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9楼2011-04-09 16:51:36
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
zhyzx(金币+1): 2011-04-09 17:44:00
1949stone(EPI+1): 鼓励 2011-04-09 17:59:06
1:大肠杆菌没有什么问题吧？建议看看你的宿主菌有无问题；
2：IPTG诱导浓度多大，各种文献都太一样，我们这里是0.2mM，当然了最好做一个梯度，1mM也做过。还有IPTG有没有什么问题？
3：什么培养基？按照楼主所说，摇着摇着就澄清了？一般情况下不太可能，就是营养物质再少也不会的。

其实实验上遇到什么问题，各个环节都要想到，包括培养基，枪头是否灭菌等等等等。。都要细细想想，分子这个东西就是这样子。
祝好运！
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10楼2011-04-09 17:37:28
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zhyzx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-09 17:37:28:
1:大肠杆菌没有什么问题吧？建议看看你的宿主菌有无问题；
2：IPTG诱导浓度多大，各种文献都太一样，我们这里是0.2mM，当然了最好做一个梯度，1mM也做过。还有IPTG有没有什么问题？
3：什么培养基？按照楼主所说 ...

谢谢！
各方面都考虑过了，培养基是LB。我今天刚摇的，还没诱导，一个小时前去看着还好好的，测了OD也有0.3了，再过一会去看就清了。
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11楼2011-04-09 17:42:32
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天使托

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by zhyzx at 2011-04-09 17:42:32:
谢谢！
各方面都考虑过了，培养基是LB。我今天刚摇的，还没诱导，一个小时前去看着还好好的，测了OD也有0.3了，再过一会去看就清了。

换宿主菌吧。。。。
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12楼2011-04-09 17:54:17
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zhyzx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-04-09 17:54:17:
换宿主菌吧。。。。

恩，好，我试试
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13楼2011-04-09 18:08:53
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qjy_134

铜虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-04-09 20:54:46
zhyzx(金币+1): 2011-04-09 21:41:37
你这样情况一般是靶蛋白有泄漏表达，你往表达的培养基里面加葡萄糖，终浓度为1%。
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14楼2011-04-09 20:12:54
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zhyzx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by qjy_134 at 2011-04-09 20:12:54:
你这样情况一般是靶蛋白有泄漏表达，你往表达的培养基里面加葡萄糖，终浓度为1%。

好的，我试试。谢谢
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15楼2011-04-09 21:41:18
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流经验 2011-04-09 23:27:14
zhyzx(金币+1): 2011-04-10 09:02:50
前几天碰到过，重新更换了感受态，也未解决问题，后来换了载体才行，楼主可以考虑下！还有公司里的感受态是否继代太多了？
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16楼2011-04-09 22:40:54
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zhyzx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2011-04-09 22:40:54:
前几天碰到过，重新更换了感受态，也未解决问题，后来换了载体才行，楼主可以考虑下！还有公司里的感受态是否继代太多了？

我也感觉公司里的感受态有问题，换载体倒是值得一试，谢谢
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17楼2011-04-10 09:02:37
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dasheng1980

铁杆木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我也遇到过这个问题，刚开始长的好好的，也能看出来长，但过了一会儿，也就1小时的样子吧，开始变清了，而且是越摇越清！
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18楼2011-12-31 20:20:21
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dasheng1980

铁杆木虫 (知名作家)
★
西瓜(金币+1): 新年快乐哈~ 2011-12-31 22:17:46
我的问题现在已经有了方向，但还没最终解决，年后吧，我有了结论和大家分享！
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19楼2011-12-31 20:22:04
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rtt0325

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+1): 鼓励交流哦 2012-01-07 17:26:35
我们碰到过这个事情的，我们是噬菌体污染了，有两个方法，把死掉的菌继续摇，有抗性的能继续活下来，那个菌似乎能用的，或者就熏蒸实验室吧……
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20楼2012-01-07 17:16:38
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dasheng1980

铁杆木虫 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我的菌种应该是在储存的过程中出了问题，-20度冰箱的温度不稳造成的！
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21楼2012-02-06 14:42:02
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李艳君2011

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+1): 鼓励交流！好奇怪啊。。。 2012-02-06 22:35:11
同样遇到这个情况，死掉的菌继续摇还可以摇混，也有蛋白表达，但是不太稳定，会反复死，希望各位帮忙找到原因，解决问题。
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22楼2012-02-06 17:06:38
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c3024034

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我推测你配制的培养基有问题，请更换后再试试
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23楼2012-02-06 18:28:00
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可蕊

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们也遇到这个问题了，不过我们使用的是无机盐+糖做培养基，最后感觉是因为大肠杆菌还有噬菌体基因，因此在尝试将此基因敲出或是其他方法。
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24楼2013-03-10 14:58:58
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可蕊

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1244479楼: Originally posted by 李艳君2011 at 2012-02-06 17:06:38
同样遇到这个情况，死掉的菌继续摇还可以摇混，也有蛋白表达，但是不太稳定，会反复死，希望各位帮忙找到原因，解决问题。

对于死后继续摇可以变浑浊，可以采取将变浑浊的菌液保存起来，然后再使用它接摇瓶，不死的话，用它划单克隆，保菌
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25楼2013-03-10 15:02:08
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李艳君2011

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1291476楼: Originally posted by 可蕊 at 2013-03-10 15:02:08
对于死后继续摇可以变浑浊，可以采取将变浑浊的菌液保存起来，然后再使用它接摇瓶，不死的话，用它划单克隆，保菌...

这方法我们试过，不靠谱，分纯N多代，还是有污染，不能放大培养。我们是噬菌体污染了
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26楼2013-03-12 12:46:09
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
多半是噬菌体的问题，涂个看看噬菌斑
提取好质粒，换个其他实验室去做做
你们实验室一时半会噬菌体搞不干净了
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27楼2013-03-12 12:51:56
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Francis_zw

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
503735楼: Originally posted by zhyzx at 2011-04-09 15:51:07
谢谢！

现在的问题是在诱导之前就出现这种情况，本来长得还好好的，再过一会就看到菌液清了。

急死了...

朋友，我以前碰到和你一模一样的的情况，一开始菌液张的不错，后来培养基变的澄清，OD也没有了，也查不出原因，后来把超净台用酒精檫了一遍，摇床也用酒精碰了一遍，并且把之前的菌的重新做转化，就没有再出现过了。个人怀疑是，质粒丢失了，要不然就是你的转化的菌拷贝数低，长着长着就质粒丢失了，被抗生素杀死。
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28楼2013-03-26 09:41:06
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