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草本凝香

铁虫 (初入文坛)

[求助] 请教大肠杆菌中蛋白表达后该如何处理

请教各位:我的多肽在大肠杆菌中诱导表达后,离心收集菌体沉淀,我想问的是这个沉淀用什么试剂重悬?我现在用的是PBS(pH8.0),不知道行不行?
还有一个问题:菌体沉淀只加某种重悬试剂,再与loading buffer混旋,煮沸上样跑电泳就可以吗?需不需要再加入裂解液之类的,我总觉得细菌都没有被裂解,跑出来的电泳条带会是全菌蛋白吗?不吝赐教,谢谢各位了
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-13 20:51:16
草本凝香(金币+1): 非常感谢:)还想请问:您说的pH值行不行,主要看蛋白质的性质。您能说的具体点吗?我刚开始接触这些知识,有很多不懂的,请您不吝赐教,谢谢您 2011-05-14 16:18:40
引用回帖:
Originally posted by 草本凝香 at 2011-05-13 20:20:19:
请教各位:我的多肽在大肠杆菌中诱导表达后,离心收集菌体沉淀,我想问的是这个沉淀用什么试剂重悬?我现在用的是PBS(pH8.0),不知道行不行?
还有一个问题:菌体沉淀只加某种重悬试剂,再与loading buffer混旋 ...

根据我们实验室的经验,Tris-HCl和PBS pH8.0均可。这个pH值行不行,主要看你的蛋白质的性质。

另一个问题:可以用以上缓冲液重悬,跑出的电泳是全菌体电泳图谱,即菌体所有蛋白条带。其中煮沸环节可以破碎细胞。
开始新的学习!
2楼2011-05-13 20:34:54
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-05-16 09:00:23
引用回帖:
Originally posted by 草本凝香 at 2011-05-13 20:20:19:
请教各位:我的多肽在大肠杆菌中诱导表达后,离心收集菌体沉淀,我想问的是这个沉淀用什么试剂重悬?我现在用的是PBS(pH8.0),不知道行不行?
还有一个问题:菌体沉淀只加某种重悬试剂,再与loading buffer混旋 ...

可以的,生理盐水、PBS、Trisl-HCl等都可以的。如果只是用来电泳,直接加水,然后加loading buffer煮沸5min就是了,煮沸条件下细胞已经破碎了,都这样用,没问题的。
3楼2011-05-14 15:09:17
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草本凝香

铁虫 (初入文坛)

谢谢各位不吝赐教~
我还有个问题:我的细菌用PBS重悬后,加loading buffer煮沸10min准备上样时,样品很粘稠,无法上样,是什么原因?我该怎么办?
4楼2011-05-14 16:24:09
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yuesheng10

金虫 (小有名气)

离心,用上清电泳
5楼2011-05-15 22:45:03
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Titiana

银虫 (小有名气)

离心就可以用上清上样
做个淡淡的小女生!
6楼2011-05-20 17:03:43
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青梅煮酒17

新虫 (初入文坛)

我做的时候沉淀也是很粘稠,无法点样。师姐也是教我离心后去上清跑的,师姐告诉我说蛋白在上清里。
7楼2012-08-08 18:27:18
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郭高杰

新虫 (正式写手)

煮沸后离心
8楼2018-12-25 14:40:40
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