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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教大肠杆菌中蛋白表达后该如何处理
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草本凝香

铁虫 (初入文坛)

[求助] 请教大肠杆菌中蛋白表达后该如何处理

请教各位：我的多肽在大肠杆菌中诱导表达后，离心收集菌体沉淀，我想问的是这个沉淀用什么试剂重悬？我现在用的是PBS（pH8.0），不知道行不行？
还有一个问题：菌体沉淀只加某种重悬试剂，再与loading buffer混旋，煮沸上样跑电泳就可以吗？需不需要再加入裂解液之类的，我总觉得细菌都没有被裂解，跑出来的电泳条带会是全菌蛋白吗？不吝赐教，谢谢各位了
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1楼 2011-05-13 20:20:19
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青梅煮酒17

新虫 (初入文坛)
我做的时候沉淀也是很粘稠，无法点样。师姐也是教我离心后去上清跑的，师姐告诉我说蛋白在上清里。
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7楼2012-08-08 18:27:18
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-13 20:51:16
草本凝香(金币+1): 非常感谢：）还想请问：您说的pH值行不行，主要看蛋白质的性质。您能说的具体点吗？我刚开始接触这些知识，有很多不懂的，请您不吝赐教，谢谢您 2011-05-14 16:18:40
引用回帖:
Originally posted by 草本凝香 at 2011-05-13 20:20:19:
请教各位：我的多肽在大肠杆菌中诱导表达后，离心收集菌体沉淀，我想问的是这个沉淀用什么试剂重悬？我现在用的是PBS（pH8.0），不知道行不行？
还有一个问题：菌体沉淀只加某种重悬试剂，再与loading buffer混旋 ...

根据我们实验室的经验，Tris-HCl和PBS pH8.0均可。这个pH值行不行，主要看你的蛋白质的性质。

另一个问题：可以用以上缓冲液重悬，跑出的电泳是全菌体电泳图谱，即菌体所有蛋白条带。其中煮沸环节可以破碎细胞。
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2楼2011-05-13 20:34:54
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-05-16 09:00:23
引用回帖:
Originally posted by 草本凝香 at 2011-05-13 20:20:19:
请教各位：我的多肽在大肠杆菌中诱导表达后，离心收集菌体沉淀，我想问的是这个沉淀用什么试剂重悬？我现在用的是PBS（pH8.0），不知道行不行？
还有一个问题：菌体沉淀只加某种重悬试剂，再与loading buffer混旋 ...

可以的，生理盐水、PBS、Trisl-HCl等都可以的。如果只是用来电泳，直接加水，然后加loading buffer煮沸5min就是了，煮沸条件下细胞已经破碎了，都这样用，没问题的。
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3楼2011-05-14 15:09:17
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草本凝香

铁虫 (初入文坛)
谢谢各位不吝赐教~
我还有个问题：我的细菌用PBS重悬后，加loading buffer煮沸10min准备上样时，样品很粘稠，无法上样，是什么原因？我该怎么办？
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4楼2011-05-14 16:24:09
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