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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 外源蛋白诱导表达量特别少，求大侠解惑
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amon7788

新虫 (初入文坛)

[求助] 外源蛋白诱导表达量特别少，求大侠解惑

本人研一，老板让我做一个蛋白的抗体，首先得将该蛋白外源诱导表达出来
我的目的基因大小是3600，目的蛋白大概130KD
用的载体是HisB，大约4400bp
酶连很顺利，开始用的是大肠JM109进行表达，0.5M的IPTG，37度诱导6小时
一跑胶发现有条带可是特别细，做了几次诱导效果都不怎么好
不知道到底是什么原因？难道因为外源片段太大了载体承受不了？或者宿主菌不对？诱导的条件需要改进？
求高人指点，不胜感激~~~·*——*
新人，没多少金币
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花枝春满，天心月圆
1楼 2011-04-18 21:19:27
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amon7788

新虫 (初入文坛)
为什么啊
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花枝春满，天心月圆
2楼2011-04-18 21:39:32
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★
amon7788(金币+2): 谢谢！我已经换了TOP10，看看效果怎么样 2011-04-19 12:19:48
wolfebst(金币+1): 感谢回帖，回答的很好，呵呵 2011-04-19 12:34:36
超过100KDa的蛋白不是很好表达，可以试试不同的宿主。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-04-18 22:34:06
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★
wolfebst(金币+1): 感谢你回答 2011-04-20 15:57:08
引用回帖:
Originally posted by amon7788 at 2011-04-18 21:19:27:
本人研一，老板让我做一个蛋白的抗体，首先得将该蛋白外源诱导表达出来
我的目的基因大小是3600，目的蛋白大概130KD
用的载体是HisB，大约4400bp
酶连很顺利，开始用的是大肠JM109进行表达，0.5M的IPTG， ...

你换Top10做什么啊，这个是克隆宿主，不是表达宿主。。。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2011-04-19 13:34:04
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wolfebst

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

对啊，你应该用表达宿主BL21或其他
而且我觉得还要看你用的是什么vector
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5楼2011-04-19 14:20:02
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amon7788

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-04-19 13:34:04:
你换Top10做什么啊，这个是克隆宿主，不是表达宿主。。。

我们这边有人就是用TOP10做HISB的表达啊,而且效果很好呢
刚用TOP10取的样跑了个胶,效果跟JM109差不多,也很细
转了BL21的刚长上
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花枝春满，天心月圆
6楼2011-04-19 17:47:19
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amon7788

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wolfebst at 2011-04-19 14:20:02:
对啊，你应该用表达宿主BL21或其他
而且我觉得还要看你用的是什么vector

呵呵,BL21转了几次了都不长的,今天终于长了,准备试一试
载体是HISB,查了一下可以用JM109和BL21,不过也有很多人用TOP10的
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花枝春满，天心月圆
7楼2011-04-19 17:58:46
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redgrape123

金虫 (小有名气)

少将

【答案】应助回帖

LZ的蛋白可溶性高吗？如果可溶性低的话纯化的两是很少的~
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8楼2011-04-20 12:05:44
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
wolfebst(金币+1): 欢迎交流 2011-04-20 15:54:31
晕死。怎么能用克隆宿主的哇。。。。

要用表达宿主。

我遇见很多这种同学了。。
一定要配套好表达载体和宿主。。。
额。。楼主好好学习下p ET系列的基本知识。
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
9楼2011-04-20 14:23:48
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amon7788

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by redgrape123 at 2011-04-20 12:05:44:
LZ的蛋白可溶性高吗？如果可溶性低的话纯化的两是很少的~

我也想了这个问题，所以今天拿沉淀跑了个胶，还不知道结果
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花枝春满，天心月圆
10楼2011-04-21 21:28:04
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