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friya0910新虫 (正式写手)
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[求助]
IPTG诱导
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| 有没有不加IPTG诱导，也能表达目的蛋白的情况存在啊？我的没加IPTG诱导培养5h的菌好像也表达我的目的蛋白了，怎么回事啊？ |
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西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-09-13 11:53:30
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-09-13 11:53:30
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同问 我也一样，1月前表达的，未加IPTG的无条带，加入IPTG的有条带，效果很好。 刚刚拿到诱导结果，发现未加IPTG的和加入的SDS-PAGE一样，都有目的蛋白条带。 总结了网上的说法： 1.IPTG残留。其不被细菌代谢，而且我的接种量很大，200ul接种5ml。 2.本底表达。细菌产生了IPTG的类似物，就是半乳糖什么的，导致未加IPTG也表达。 3.菌浓度太高的时候加入了IPTG，可能由于第一条，这样，细菌本身有本地表达，摇的时间很长的时候，本底表达高，而在OD值高的时候加入IPTG后，表达量会降低，所以在SDS-PAGE上显示差不多 |
9楼2011-09-13 10:40:49
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2楼2011-09-01 19:01:13
天使托
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3楼2011-09-01 19:20:46
xbl3688
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4楼2011-09-01 19:28:13
friya0910
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http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3538745 上面有我跑的全菌蛋白的图，麻烦您帮我看看，这图能说明我的蛋白表达了吗？这图没跑未加IPTG的菌培养5h的情况，我今天跑的上清和沉淀，发现未加IPTG的菌培养5h后上清中都有我的目的蛋白，于是我就困惑了……等脱完色把图传上来让您帮我看看，成吗？ |
5楼2011-09-01 19:30:36
天使托
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6楼2011-09-01 19:42:54
friya0910
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7楼2011-09-01 20:18:27
【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5, MolEPI+1): 再接再厉、 2011-09-02 07:00:58
friya0910(金币+2): 2011-09-04 14:59:15
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 再接再厉、 2011-09-02 07:00:58
friya0910(金币+2): 2011-09-04 14:59:15
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最近准备做pET系统的表达，查了一些资料。发现pET的诱导表达有两种情况：①监测OD值，0.5~0.6时添加IPTG的诱导，②使用自诱导培养基。 关于自诱导培养基，你可以看一下这个帖子：”PET系统蛋白表达自动诱导培养基、大幅度提高产量“，在很多网站上有转载。 对于你的问题，这篇帖子中有描述：【但为了解决表达型质粒的自发诱导的问题（就是不加诱导剂，菌液摇到饱和时总有目的蛋白自动表达的问题，这也是有毒蛋白不能表达的原因），他彻底研究了培养基的每一种组分，最后发现是胰蛋白胨里的少量的乳糖在作怪，他同时又发现了葡萄糖，和氨基酸能抑止乳糖的诱导，在培养基的研究中，他发明了全新的培养基组分，在这种培养基里，菌液的OD值很简单的就能达到5－50左右，在此基础上，他发明了自动诱导系统。】 自诱导培养基，studier文献中的配方感觉太复杂，尤其18 种aa。 我再网上找到了中简单的配方，组成： Autoclave /1L - Phosphate Buffer (pH 7.2) 6g Na2HPO4/3g KH2PO4 - Tryptone 20 g - Yeast Extract 5 g - NaCl 5 g Filter sterilise - 60 % v/v Glycerol 10 ml - 10 % w/v Glucose 5 ml - 8 % w/v Lactose 25 ml 我要等两天做表达， 对于这个配方不知道你有没有兴趣， 有兴趣的话，可以交流一下此配方的 表达效果。 |
8楼2011-09-01 21:08:47
临风7071
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10楼2011-09-17 22:54:15
