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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纯化出的蛋白没有活性，求教！
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zoeye

金虫 (小有名气)

[求助] 纯化出的蛋白没有活性，求教！

GST纯化一种磷酸酶
但是做活性却检测不出来
请问要纯化的酶有活性应该注意什么呢？

隔壁实验室的师兄磷酸酶都保存在四度的
说事-20就会失活？ 是这样吗？
我纯完放在-80°的 难道是因为放在-80的原因？
而且我都是超声裂菌的 是不是也会影响酶活啊？
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1楼 2012-03-21 19:21:52
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回帖置顶 ( 共有1个 )

imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zoeye: 金币+2, ★★★很有帮助, 请问您有用过4B的柱子吗 柱子纯完了直接用PBS洗洗放20%乙醇就可以嘛？ 还是每次都要重生，保存？ 有人说4B的柱子能用好久，好久才需要重生一次呢 2012-03-23 23:12:56
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 高人！ 2012-03-25 14:13:42
楼上诸位说的都有一定道理
首先：超声对酶的活性是有影响的，磷酸酶的化学本质是蛋白质，超声破碎菌体时会大量产热，高温就会使酶失活，所以一般超声都需要冰浴；此外，也有些人认为超声功率过大会导致部分肽键断裂，不过没有被证实；总之，超声的条件是很重要的。
其次：纯化时应注意选用低盐浓度洗脱得到的蛋白，浓度越高对酶的影响越大，一般纯化之后的酶都要经过脱盐或是透析来除盐。
再次：你的蛋白虽然纯化出来了，但是并不代表就一定正确折叠了，可能会像包涵体一样不具有活性，这样你就要考虑是否进行变复性了，不过一般来说变复性得到的酶活性都比较差。
最后：你在测酶活时的条件很重要，最好严格控制，先按照文献提供的条件试试，好文章里的试验结果重复性都是很好的，只要你按照他说的做就是了。
     最好万事靠自己，别人摸索的条件没发文章前不要去问，免得别人为难，自己尴尬……
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
12楼2012-03-23 23:07:05
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-03-23 14:33:17
多看看关于磷酸酶的文献，特别是磷酸酶性质相关的，能找到关键点。比如是否有一些离子或物质抑制这个酶的活性，是否需要加入一些物质才有活性（有的金属酶需要加入金属离子构成活性中心才有活性的），失活的条件，GST标签是否有影响（一般是要切除标签的）。磷酸酶是很常见的酶，GST标签表达纯化也肯定有人做，文献很多的，去找找看。
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8楼2012-03-22 21:53:43
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励帮助解答问题！ 2012-03-21 20:57:20
如果时间短最好不要放-80，一冻一融很容易沉淀和变性失活的，要放-20或-80加点甘油要好些，一般一两周就放4度，纯化完，标签切除后就应该马上测活性。做蛋白一定要注意能快尽量快，避免失活，影响实验结果。
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2楼2012-03-21 20:54:02
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-03-21 20:54:02:
如果时间短最好不要放-80，一冻一融很容易沉淀和变性失活的，要放-20或-80加点甘油要好些，一般一两周就放4度，纯化完，标签切除后就应该马上测活性。做蛋白一定要注意能快尽量快，避免失活，影响实验结果。

超声裂解会有活性吗 我已经重新纯了 然后立马测了活性 还是没有
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3楼2012-03-22 09:37:30
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, g鼓励交流！ 2012-03-25 14:11:55
其实你身边就有很好的资源，既然你的隔壁实验室的师兄做过那你跟他请教一下是最好的了，蛋白纯化过程中超声破碎步骤是有可能让蛋白失活的，还有就是最后用高浓度的盐洗脱目的蛋白后要通过超滤等方法降低盐离子的浓度，不然也会影响蛋白活性
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4楼2012-03-22 10:09:48
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zh10008100

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-25 14:12:05
GST纯化，是带着GST标签的吗？有没有将GST标签切掉？结构预测酶活性中心在哪一个区段？GST不小了，有一定的空间位阻的，另外纯化后buffer的PH和离子浓度有摸条件吗
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5楼2012-03-22 12:35:54
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zh10008100 at 2012-03-22 12:35:54:
GST纯化，是带着GST标签的吗？有没有将GST标签切掉？结构预测酶活性中心在哪一个区段？GST不小了，有一定的空间位阻的，另外纯化后buffer的PH和离子浓度有摸条件吗

你好 是带着标签的
我是学药理的 第一做这个
不知道要怎么摸索条件啊？
我用的是GE的GST的柱子 就按照上面的要求将蛋白溶在ELUTION BUFFER里的 ph8.0
请问要作蛋白活性的话 一般纯完要作哪些啊？
我原本以为纯出来就应该有活性的呢
我看有的文献上还写着refolding 就是让蛋白折叠成应有的空间结构？ 这个要怎么做啊？
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6楼2012-03-22 15:23:34
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-03-22 10:09:48:
其实你身边就有很好的资源，既然你的隔壁实验室的师兄做过那你跟他请教一下是最好的了，蛋白纯化过程中超声破碎步骤是有可能让蛋白失活的，还有就是最后用高浓度的盐洗脱目的蛋白后要通过超滤等方法降低盐离子的浓 ...

额。。那事生化的师兄 而且人家不纯蛋白 也不清楚
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7楼2012-03-22 15:29:40
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-03-22 21:53:43:
多看看关于磷酸酶的文献，特别是磷酸酶性质相关的，能找到关键点。比如是否有一些离子或物质抑制这个酶的活性，是否需要加入一些物质才有活性（有的金属酶需要加入金属离子构成活性中心才有活性的），失活的条件， ...

谢谢你的建议 我去查文献了
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9楼2012-03-22 22:45:01
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rodickholm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-03-25 14:12:17
有些酶需要加入辅酶，当然翻译后修饰也很重要，建议使用真核表达
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10楼2012-03-23 09:20:35
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