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纯化出的蛋白没有活性，求教！
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GST纯化一种磷酸酶 但是做活性却检测不出来 请问要纯化的酶有活性应该注意什么呢？ 隔壁实验室的师兄磷酸酶都保存在四度的 说事-20就会失活？ 是这样吗？ 我纯完放在-80°的 难道是因为放在-80的原因？ 而且我都是超声裂菌的 是不是也会影响酶活啊？ |
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imyting
至尊木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
zoeye: 金币+2, ★★★很有帮助, 请问您有用过4B的柱子吗 柱子纯完了直接用PBS洗洗放20%乙醇就可以嘛？ 还是每次都要重生，保存？ 有人说4B的柱子能用好久，好久才需要重生一次呢 2012-03-23 23:12:56
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 高人！ 2012-03-25 14:13:42
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zoeye: 金币+2, ★★★很有帮助, 请问您有用过4B的柱子吗 柱子纯完了直接用PBS洗洗放20%乙醇就可以嘛？ 还是每次都要重生，保存？ 有人说4B的柱子能用好久，好久才需要重生一次呢 2012-03-23 23:12:56
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 高人！ 2012-03-25 14:13:42
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楼上诸位说的都有一定道理 首先：超声对酶的活性是有影响的，磷酸酶的化学本质是蛋白质，超声破碎菌体时会大量产热，高温就会使酶失活，所以一般超声都需要冰浴；此外，也有些人认为超声功率过大会导致部分肽键断裂，不过没有被证实；总之，超声的条件是很重要的。 其次：纯化时应注意选用低盐浓度洗脱得到的蛋白，浓度越高对酶的影响越大，一般纯化之后的酶都要经过脱盐或是透析来除盐。 再次：你的蛋白虽然纯化出来了，但是并不代表就一定正确折叠了，可能会像包涵体一样不具有活性，这样你就要考虑是否进行变复性了，不过一般来说变复性得到的酶活性都比较差。 最后：你在测酶活时的条件很重要，最好严格控制，先按照文献提供的条件试试，好文章里的试验结果重复性都是很好的，只要你按照他说的做就是了。 最好万事靠自己，别人摸索的条件没发文章前不要去问，免得别人为难，自己尴尬…… |
12楼2012-03-23 23:07:05
zxc6884
铁杆木虫 (著名写手)
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2楼2012-03-21 20:54:02
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4楼2012-03-22 10:09:48