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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纯化出的蛋白没有活性，求教！
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zoeye

金虫 (小有名气)

[求助] 纯化出的蛋白没有活性，求教！

GST纯化一种磷酸酶
但是做活性却检测不出来
请问要纯化的酶有活性应该注意什么呢？

隔壁实验室的师兄磷酸酶都保存在四度的
说事-20就会失活？ 是这样吗？
我纯完放在-80°的 难道是因为放在-80的原因？
而且我都是超声裂菌的 是不是也会影响酶活啊？
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1楼 2012-03-21 19:21:52
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-03-22 21:53:43:
多看看关于磷酸酶的文献，特别是磷酸酶性质相关的，能找到关键点。比如是否有一些离子或物质抑制这个酶的活性，是否需要加入一些物质才有活性（有的金属酶需要加入金属离子构成活性中心才有活性的），失活的条件， ...

谢谢你的建议 我去查文献了
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9楼2012-03-22 22:45:01
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励帮助解答问题！ 2012-03-21 20:57:20
如果时间短最好不要放-80，一冻一融很容易沉淀和变性失活的，要放-20或-80加点甘油要好些，一般一两周就放4度，纯化完，标签切除后就应该马上测活性。做蛋白一定要注意能快尽量快，避免失活，影响实验结果。
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2楼2012-03-21 20:54:02
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zoeye

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-03-21 20:54:02:
如果时间短最好不要放-80，一冻一融很容易沉淀和变性失活的，要放-20或-80加点甘油要好些，一般一两周就放4度，纯化完，标签切除后就应该马上测活性。做蛋白一定要注意能快尽量快，避免失活，影响实验结果。

超声裂解会有活性吗 我已经重新纯了 然后立马测了活性 还是没有
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3楼2012-03-22 09:37:30
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, g鼓励交流！ 2012-03-25 14:11:55
其实你身边就有很好的资源，既然你的隔壁实验室的师兄做过那你跟他请教一下是最好的了，蛋白纯化过程中超声破碎步骤是有可能让蛋白失活的，还有就是最后用高浓度的盐洗脱目的蛋白后要通过超滤等方法降低盐离子的浓度，不然也会影响蛋白活性
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4楼2012-03-22 10:09:48
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