应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求教离子交换柱纯化蛋白的问题
291/3返回列表123下一页
查看: 2092  |  回复: 28
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

amq7392

木虫 (著名写手)

[求助] 求教离子交换柱纯化蛋白的问题

本人用DEAE Sepharose FF纯化一种酶，柱子为1.6X30cm，柱床高约20cm，上样缓冲液20mM Tris-HCl，用0—0.5M NaCl梯度洗脱，流速约2ml/min。问题是：在整个梯度洗脱过程中仅出现一个很大的峰，峰高A280不到0.02，但特别宽，三四个小时才出完，经检测酶活，我的目标产物就存在于整个峰中。我重复了两三次，都是这种情况，请问这是怎么回事？是我装柱有问题还是洗脱条件有问题？还有就是，当梯度完后，高盐洗脱时（1M NaCl），柱床高度下降明显，有两三个厘米，这是怎么回事呢？谢谢各位！

[ Last edited by amq7392 on 2012-3-13 at 19:24 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2012-03-13 19:20:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

baodongq

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-03-20 11:14:25
本帖内容被屏蔽
28楼2012-03-16 17:00:15
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

120548382

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是缓冲体系的PH的问题，你调一下缓冲体系的PH改变，重新尝试一下，应该就能挂柱了
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2012-03-14 21:32:20
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+1, ★有帮助 2012-03-20 10:56:08
高盐洗脱时（1M NaCl），柱床高度下降明显，有两三个厘米，这是怎么回事呢？  感觉是你的柱子没有装好，重装下柱子试试吧，如果还不行的话，在考虑别的问题。在有上样的流速可以减小点。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-03-14 22:30:15
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)
确定一下是否是DEAE sep ff
听着怎么像A50之流。
DEAE曾用2m氢氧化钠处理过，包括乙醇、酸我均用过在线清洗，也没见有床体积变化。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-03-15 08:46:51
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
再过柱子之前应该让缓冲液过上一夜，把柱子里的填料压实。建议用5%梯度洗脱，这样每个梯度，应该有个峰。
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2012-03-15 08:58:27
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihuan0525

金虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 08:52:28:
重装过几次，都是这种情况，柱床塌陷，流速变得很慢，三四秒一滴。跑出来的峰都是这样：一个很低很宽的大峰。线性梯度太缓会不会导致峰变宽呢？梯度陡一些会不会改善峰形？

请问你的目标蛋白的等电点多少，你用的缓冲液的PH是多少，一般离子交换的ph和等电点相差一个ph
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2012-03-15 12:52:40
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihuan0525

金虫 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 13:02:42:
文献中报道的这种酶的等电点从4点几到6点几不等，不同菌种产的酶是不太一样的，我也不清楚我的酶等电点多少。我开始用pH6.5的磷酸缓冲液，发现穿透峰有酶活，挂柱不牢，故改为pH8.0的Tris-HCl。

先把等电点弄清楚了吧，这样的话你摸条件的时候也容易点
赞一下(1人) 回复此楼
14楼2012-03-15 13:10:35
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sspxiaoji

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+1, ★有帮助 2012-03-20 11:13:57
1、很明显，你的柱子没有装好，但即使这样也不至于出现你描述的问题；
2、你的梯度洗脱液描述的很模糊，但也不会出现你说的问题；
我觉得最有可能的是你的样品量太小，柱子太大了。最好检查下检测器有没有问题。
赞一下(1人) 回复此楼
26楼2012-03-16 10:48:55
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白上样量过浓了，超过树脂的上载量了
赞一下(1人) 回复此楼
27楼2012-03-16 13:32:07
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

amq7392

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 120548382 at 2012-03-14 21:32:20:
应该是缓冲体系的PH的问题，你调一下缓冲体系的PH改变，重新尝试一下，应该就能挂柱了

我可能没把问题说清楚。我样品能挂柱，穿透峰里没有目标蛋白跑出来。是梯度洗脱时出峰异常。
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-15 08:48:10
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amq7392

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-03-14 22:30:15:
高盐洗脱时（1M NaCl），柱床高度下降明显，有两三个厘米，这是怎么回事呢？  感觉是你的柱子没有装好，重装下柱子试试吧，如果还不行的话，在考虑别的问题。在有上样的流速可以减小点。

重装过几次，都是这种情况，柱床塌陷，流速变得很慢，三四秒一滴。跑出来的峰都是这样：一个很低很宽的大峰。线性梯度太缓会不会导致峰变宽呢？梯度陡一些会不会改善峰形？
赞一下 回复此楼
6楼2012-03-15 08:52:28
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amq7392

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lzgxgz at 2012-03-15 08:46:51:
确定一下是否是DEAE sep ff
听着怎么像A50之流。
DEAE曾用2m氢氧化钠处理过，包括乙醇、酸我均用过在线清洗，也没见有床体积变化。

是GE的DEAE Sepharose FF，说明书都在，错不了。不过可能用过的次数多了，里面有一些絮状东西，怀疑是不是填料有问题了。
赞一下 回复此楼
8楼2012-03-15 09:37:42
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amq7392

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by yuanbo934 at 2012-03-15 08:58:27:
再过柱子之前应该让缓冲液过上一夜，把柱子里的填料压实。建议用5%梯度洗脱，这样每个梯度，应该有个峰。

过一夜会消耗N升缓冲液啊，呵呵。“5%梯度洗脱”啥意思？
赞一下 回复此楼
9楼2012-03-15 09:40:14
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 09:40:14:
过一夜会消耗N升缓冲液啊，呵呵。“5%梯度洗脱”啥意思？

平衡是要几倍柱体积的，是不没有平衡过来啊，确定上样前平衡液的ph是目的ph？
赞一下 回复此楼
10楼2012-03-15 11:43:12
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 amq7392 的主题更新
291/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 第一篇论文投稿进程记录 +6 慎独的小花卷 2024-06-20 11/550 2024-06-26 22:30 by 克己静学
[基金申请] 专科院校申请国自然 +14 孤单12站 2024-06-24 21/1050 2024-06-26 22:03 by 514205406
[公派出国] CSC博士联培对将来就业有用吗 +5 也就这样 2024-06-22 5/250 2024-06-26 20:55 by tshenbin
[考博] 对象没有，还非常想读博，难以抉择 +28 pvrw0224 2024-06-23 52/2600 2024-06-26 20:22 by pvrw0224
[考研] 刚当完兵回来想考研 +7 五官在线 2024-06-23 18/900 2024-06-26 17:05 by 1158057902
[基金申请] 国产期刊影响因子大于12的有20多个个了 +19 babu2015 2024-06-20 24/1200 2024-06-26 16:57 by deliciou
[硕博家园] 博士该不该读？ +8 L1009225316 2024-06-25 8/400 2024-06-26 16:26 by huixiong0627
[基金申请] 省基金对国自然申请是有利还是有弊 +6 zycumt04 2024-06-26 7/350 2024-06-26 15:02 by 潇湘之迷
[教师之家] 神奇的中医 +8 水冰月月野兔 2024-06-24 10/500 2024-06-26 12:10 by lyfbangong
[基金申请] 今天能不能出来名单 +8 地理学1995 2024-06-25 10/500 2024-06-26 09:46 by msjy
[有机交流] 过柱子，产品，杂质在是 pe:ea=100:1 也一起出来？ +5 w256 2024-06-25 5/250 2024-06-26 09:31 by 小木木cc
[基金申请] 基金申请书名称有变化 +5 xuel2011 2024-06-25 7/350 2024-06-26 00:07 by 老虎当猫养
[考博] 申博好难 +6 自强不息a?a 2024-06-24 6/300 2024-06-25 23:02 by 考研吒儿
[基金申请] 这样的说辞是上会了吗 +12 学员d3zYCz 2024-06-24 15/750 2024-06-25 22:05 by 3115321
[考博] 没读上博，好焦虑！ +6 wangzhe_bs 2024-06-24 8/400 2024-06-25 21:15 by wangzhe_bs
[硕博家园] 数据不好 +5 Hetai 2024-06-23 7/350 2024-06-25 12:37 by 1591099
[教师之家] 复旦夏同学提出高校成年人学生退学不应该让家长审核，大家认同吗？ +10 苏东坡二世 2024-06-22 17/850 2024-06-24 16:52 by wanghuawei
[催化] 求助原位红外 +3 jfdhj 2024-06-21 7/350 2024-06-24 10:52 by qvhm2609
[基金申请] 国自然青年基金，1A4B能上会吗？青年和面上的上会标准是一样的吗？ +19 今晚推荐22 2024-06-20 32/1600 2024-06-23 23:17 by andywei1028
[基金申请] 工材口青年基金大概什么样能上会？ +15 今晚推荐22 2024-06-20 21/1050 2024-06-22 23:04 by qbn0326
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭