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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求教离子交换柱纯化蛋白的问题
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
★ ★
telomerase: 金币+2, 谢谢你的热心应助 2012-03-17 15:41:04
引用回帖:
15楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 14:23:08:
请问在酶尚未纯化出来之前，有啥办法能弄清它的等电点呢？

这个我也没有做过，你从网上查查资料吧
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21楼2012-03-15 18:41:05
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
telomerase: 金币+2, 谢谢你的热心应助 2012-03-17 15:40:19
引用回帖:
20楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 15:15:45:
嗯，我每次过完柱子都用氢氧化钠处理的。如果真是填料坏了，那就必须换了。

要是这样，还真不好说因为什么，
也许是有蛋白在等电点，浓度高时有析出，在洗脱时析出导致堵塞
1m盐再生时要不就换个ph
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22楼2012-03-15 19:14:52
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by lzgxgz at 2012-03-15 19:14:52:
要是这样，还真不好说因为什么，
也许是有蛋白在等电点，浓度高时有析出，在洗脱时析出导致堵塞
1m盐再生时要不就换个ph

嗯，谢谢你的建议，我试一下吧。
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23楼2012-03-16 09:12:38
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 09:40:14:
过一夜会消耗N升缓冲液啊，呵呵。“5%梯度洗脱”啥意思？

上样时应该注意电导变化，如果电导发生明显变化，说明你上的样品与缓冲液离子强度不同，最终导致蛋白挂不上住。“5%梯度洗脱“AKT”一共有三个泵，其中两个与洗脱有关的泵A,B.一般用A1上缓冲液，B1上洗脱液一般用（缓冲液+1M Nacl)，5%梯度洗脱就是缓冲液加上5%B1的缓冲液洗脱,然后用10%洗脱，15%洗脱，以此类推。这样没洗脱一次就应该有个峰值。
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24楼2012-03-16 10:12:31
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jylingg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
柱床的体积与上样量是一定有联系的，要充分平衡柱床，不能有气泡，收集时的滴速不能过快，还要进行酸碱平衡，蛋白才不会变性
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25楼2012-03-16 10:14:05
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sspxiaoji

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+1, ★有帮助 2012-03-20 11:13:57
1、很明显，你的柱子没有装好，但即使这样也不至于出现你描述的问题；
2、你的梯度洗脱液描述的很模糊，但也不会出现你说的问题；
我觉得最有可能的是你的样品量太小，柱子太大了。最好检查下检测器有没有问题。
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26楼2012-03-16 10:48:55
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白上样量过浓了，超过树脂的上载量了
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27楼2012-03-16 13:32:07
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baodongq

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-03-20 11:14:25
本帖内容被屏蔽
28楼2012-03-16 17:00:15
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chen_xiao_xu

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amq7392: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-19 15:23:12
你的柱子压的不实把，再一个就是你用1M Nacl洗脱时的流速多大？是不是流速大把柱料压塌了。你的样品是不是很脏啊；洗脱峰很宽，你可以用分步梯度洗脱：如50mM nacl、100mM nacl、分布洗脱，用线性梯度洗脱容易把峰托宽，在一个就是你测测你装的柱子的柱效是不是很好。
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29楼2013-08-19 10:49:52
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