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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求教离子交换柱纯化蛋白的问题
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 求教离子交换柱纯化蛋白的问题

本人用DEAE Sepharose FF纯化一种酶，柱子为1.6X30cm，柱床高约20cm，上样缓冲液20mM Tris-HCl，用0—0.5M NaCl梯度洗脱，流速约2ml/min。问题是：在整个梯度洗脱过程中仅出现一个很大的峰，峰高A280不到0.02，但特别宽，三四个小时才出完，经检测酶活，我的目标产物就存在于整个峰中。我重复了两三次，都是这种情况，请问这是怎么回事？是我装柱有问题还是洗脱条件有问题？还有就是，当梯度完后，高盐洗脱时（1M NaCl），柱床高度下降明显，有两三个厘米，这是怎么回事呢？谢谢各位！

[ Last edited by amq7392 on 2012-3-13 at 19:24 ]
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1楼 2012-03-13 19:20:20
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chen_xiao_xu

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amq7392: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-19 15:23:12
你的柱子压的不实把，再一个就是你用1M Nacl洗脱时的流速多大？是不是流速大把柱料压塌了。你的样品是不是很脏啊；洗脱峰很宽，你可以用分步梯度洗脱：如50mM nacl、100mM nacl、分布洗脱，用线性梯度洗脱容易把峰托宽，在一个就是你测测你装的柱子的柱效是不是很好。
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29楼2013-08-19 10:49:52
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120548382

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是缓冲体系的PH的问题，你调一下缓冲体系的PH改变，重新尝试一下，应该就能挂柱了
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2楼2012-03-14 21:32:20
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+1, ★有帮助 2012-03-20 10:56:08
高盐洗脱时（1M NaCl），柱床高度下降明显，有两三个厘米，这是怎么回事呢？  感觉是你的柱子没有装好，重装下柱子试试吧，如果还不行的话，在考虑别的问题。在有上样的流速可以减小点。
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3楼2012-03-14 22:30:15
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)
确定一下是否是DEAE sep ff
听着怎么像A50之流。
DEAE曾用2m氢氧化钠处理过，包括乙醇、酸我均用过在线清洗，也没见有床体积变化。
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4楼2012-03-15 08:46:51
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