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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求教离子交换柱纯化蛋白的问题
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amq7392

木虫 (著名写手)

[求助] 求教离子交换柱纯化蛋白的问题

本人用DEAE Sepharose FF纯化一种酶，柱子为1.6X30cm，柱床高约20cm，上样缓冲液20mM Tris-HCl，用0—0.5M NaCl梯度洗脱，流速约2ml/min。问题是：在整个梯度洗脱过程中仅出现一个很大的峰，峰高A280不到0.02，但特别宽，三四个小时才出完，经检测酶活，我的目标产物就存在于整个峰中。我重复了两三次，都是这种情况，请问这是怎么回事？是我装柱有问题还是洗脱条件有问题？还有就是，当梯度完后，高盐洗脱时（1M NaCl），柱床高度下降明显，有两三个厘米，这是怎么回事呢？谢谢各位！

[ Last edited by amq7392 on 2012-3-13 at 19:24 ]
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1楼2012-03-13 19:20:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

baodongq

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2012-03-20 11:14:25
本帖内容被屏蔽
28楼2012-03-16 17:00:15
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120548382

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该是缓冲体系的PH的问题，你调一下缓冲体系的PH改变，重新尝试一下，应该就能挂柱了
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2楼2012-03-14 21:32:20
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+1, ★有帮助 2012-03-20 10:56:08
高盐洗脱时（1M NaCl），柱床高度下降明显，有两三个厘米，这是怎么回事呢？  感觉是你的柱子没有装好，重装下柱子试试吧，如果还不行的话，在考虑别的问题。在有上样的流速可以减小点。
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3楼2012-03-14 22:30:15
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)
确定一下是否是DEAE sep ff
听着怎么像A50之流。
DEAE曾用2m氢氧化钠处理过，包括乙醇、酸我均用过在线清洗，也没见有床体积变化。
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4楼2012-03-15 08:46:51
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
再过柱子之前应该让缓冲液过上一夜，把柱子里的填料压实。建议用5%梯度洗脱，这样每个梯度，应该有个峰。
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7楼2012-03-15 08:58:27
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 08:52:28:
重装过几次，都是这种情况，柱床塌陷，流速变得很慢，三四秒一滴。跑出来的峰都是这样：一个很低很宽的大峰。线性梯度太缓会不会导致峰变宽呢？梯度陡一些会不会改善峰形？

请问你的目标蛋白的等电点多少，你用的缓冲液的PH是多少，一般离子交换的ph和等电点相差一个ph
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11楼2012-03-15 12:52:40
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 13:02:42:
文献中报道的这种酶的等电点从4点几到6点几不等，不同菌种产的酶是不太一样的，我也不清楚我的酶等电点多少。我开始用pH6.5的磷酸缓冲液，发现穿透峰有酶活，挂柱不牢，故改为pH8.0的Tris-HCl。

先把等电点弄清楚了吧，这样的话你摸条件的时候也容易点
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14楼2012-03-15 13:10:35
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sspxiaoji

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amq7392: 金币+1, ★有帮助 2012-03-20 11:13:57
1、很明显，你的柱子没有装好，但即使这样也不至于出现你描述的问题；
2、你的梯度洗脱液描述的很模糊，但也不会出现你说的问题；
我觉得最有可能的是你的样品量太小，柱子太大了。最好检查下检测器有没有问题。
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26楼2012-03-16 10:48:55
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白上样量过浓了，超过树脂的上载量了
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27楼2012-03-16 13:32:07
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普通回帖

amq7392

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 120548382 at 2012-03-14 21:32:20:
应该是缓冲体系的PH的问题，你调一下缓冲体系的PH改变，重新尝试一下，应该就能挂柱了

我可能没把问题说清楚。我样品能挂柱，穿透峰里没有目标蛋白跑出来。是梯度洗脱时出峰异常。
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5楼2012-03-15 08:48:10
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amq7392

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-03-14 22:30:15:
高盐洗脱时（1M NaCl），柱床高度下降明显，有两三个厘米，这是怎么回事呢？  感觉是你的柱子没有装好，重装下柱子试试吧，如果还不行的话，在考虑别的问题。在有上样的流速可以减小点。

重装过几次，都是这种情况，柱床塌陷，流速变得很慢，三四秒一滴。跑出来的峰都是这样：一个很低很宽的大峰。线性梯度太缓会不会导致峰变宽呢？梯度陡一些会不会改善峰形？
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6楼2012-03-15 08:52:28
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amq7392

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lzgxgz at 2012-03-15 08:46:51:
确定一下是否是DEAE sep ff
听着怎么像A50之流。
DEAE曾用2m氢氧化钠处理过，包括乙醇、酸我均用过在线清洗，也没见有床体积变化。

是GE的DEAE Sepharose FF，说明书都在，错不了。不过可能用过的次数多了，里面有一些絮状东西，怀疑是不是填料有问题了。
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8楼2012-03-15 09:37:42
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amq7392

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by yuanbo934 at 2012-03-15 08:58:27:
再过柱子之前应该让缓冲液过上一夜，把柱子里的填料压实。建议用5%梯度洗脱，这样每个梯度，应该有个峰。

过一夜会消耗N升缓冲液啊，呵呵。“5%梯度洗脱”啥意思？
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9楼2012-03-15 09:40:14
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 09:40:14:
过一夜会消耗N升缓冲液啊，呵呵。“5%梯度洗脱”啥意思？

平衡是要几倍柱体积的，是不没有平衡过来啊，确定上样前平衡液的ph是目的ph？
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10楼2012-03-15 11:43:12
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