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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求教离子交换柱纯化蛋白的问题
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 08:52:28:
重装过几次，都是这种情况，柱床塌陷，流速变得很慢，三四秒一滴。跑出来的峰都是这样：一个很低很宽的大峰。线性梯度太缓会不会导致峰变宽呢？梯度陡一些会不会改善峰形？

请问你的目标蛋白的等电点多少，你用的缓冲液的PH是多少，一般离子交换的ph和等电点相差一个ph
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11楼2012-03-15 12:52:40
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by lzgxgz at 2012-03-15 11:43:12:
平衡是要几倍柱体积的，是不没有平衡过来啊，确定上样前平衡液的ph是目的ph？

这个我知道，肯定已经充分平衡了的，虽然没用缓冲液平衡一夜。填料也肯定不会错，肯定是DEAE sep ff，不会犯这些错误的。
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12楼2012-03-15 12:53:12
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-03-15 12:52:40:
请问你的目标蛋白的等电点多少，你用的缓冲液的PH是多少，一般离子交换的ph和等电点相差一个ph

文献中报道的这种酶的等电点从4点几到6点几不等，不同菌种产的酶是不太一样的，我也不清楚我的酶等电点多少。我开始用pH6.5的磷酸缓冲液，发现穿透峰有酶活，挂柱不牢，故改为pH8.0的Tris-HCl。
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13楼2012-03-15 13:02:42
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by amq7392 at 2012-03-15 13:02:42:
文献中报道的这种酶的等电点从4点几到6点几不等，不同菌种产的酶是不太一样的，我也不清楚我的酶等电点多少。我开始用pH6.5的磷酸缓冲液，发现穿透峰有酶活，挂柱不牢，故改为pH8.0的Tris-HCl。

先把等电点弄清楚了吧，这样的话你摸条件的时候也容易点
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14楼2012-03-15 13:10:35
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-03-15 13:10:35:
先把等电点弄清楚了吧，这样的话你摸条件的时候也容易点

请问在酶尚未纯化出来之前，有啥办法能弄清它的等电点呢？
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15楼2012-03-15 14:23:08
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的蛋白可能存在多种构型
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16楼2012-03-15 14:51:12
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

目的蛋白是不是发酵所得？
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17楼2012-03-15 14:51:52
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 狐狸尾巴 at 2012-03-15 14:51:52:
目的蛋白是不是发酵所得？

目的蛋白是真菌胞内酶，样品为菌丝匀浆提取液经硫酸铵沉淀后所得。
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18楼2012-03-15 14:59:41
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)
感觉是填料的问题，换试试，要不2m氢氧化钠再生一下
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19楼2012-03-15 15:01:24
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amq7392

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by lzgxgz at 2012-03-15 15:01:24:
感觉是填料的问题，换试试，要不2m氢氧化钠再生一下

嗯，我每次过完柱子都用氢氧化钠处理的。如果真是填料坏了，那就必须换了。
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20楼2012-03-15 15:15:45
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