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amq7392

木虫 (著名写手)

[求助] 求教离子交换柱纯化蛋白的问题

本人用DEAE Sepharose FF纯化一种酶,柱子为1.6X30cm,柱床高约20cm,上样缓冲液20mM Tris-HCl,用0—0.5M NaCl梯度洗脱,流速约2ml/min。问题是:在整个梯度洗脱过程中仅出现一个很大的峰,峰高A280不到0.02,但特别宽,三四个小时才出完,经检测酶活,我的目标产物就存在于整个峰中。我重复了两三次,都是这种情况,请问这是怎么回事?是我装柱有问题还是洗脱条件有问题?还有就是,当梯度完后,高盐洗脱时(1M NaCl),柱床高度下降明显,有两三个厘米,这是怎么回事呢?谢谢各位!

[ Last edited by amq7392 on 2012-3-13 at 19:24 ]
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amq7392

木虫 (著名写手)

引用回帖:
: Originally posted by lzgxgz at 2012-03-15 08:46:51:
确定一下是否是DEAE sep ff
听着怎么像A50之流。
DEAE曾用2m氢氧化钠处理过,包括乙醇、酸我均用过在线清洗,也没见有床体积变化。

是GE的DEAE Sepharose FF,说明书都在,错不了。不过可能用过的次数多了,里面有一些絮状东西,怀疑是不是填料有问题了。
8楼2012-03-15 09:37:42
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120548382

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该是缓冲体系的PH的问题,你调一下缓冲体系的PH改变,重新尝试一下,应该就能挂柱了
2楼2012-03-14 21:32:20
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amq7392: 金币+1, 有帮助 2012-03-20 10:56:08
高盐洗脱时(1M NaCl),柱床高度下降明显,有两三个厘米,这是怎么回事呢?  感觉是你的柱子没有装好,重装下柱子试试吧,如果还不行的话,在考虑别的问题。在有上样的流速可以减小点。
3楼2012-03-14 22:30:15
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)

确定一下是否是DEAE sep ff
听着怎么像A50之流。
DEAE曾用2m氢氧化钠处理过,包括乙醇、酸我均用过在线清洗,也没见有床体积变化。
4楼2012-03-15 08:46:51
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