应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 渗透冲击法 裂解诱导后的E.coli BL21(DE3)，提纯HIS-tag蛋白，求指导
51/1返回列表
查看: 2106  |  回复: 12
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

nmgdwg

银虫 (小有名气)

[交流] 渗透冲击法 裂解诱导后的E.coli BL21(DE3)，提纯HIS-tag蛋白，求指导

最近在做220KD His-tag蛋白，最近试了下渗透冲击法提蛋白，用高渗40%（W/V）蔗糖处理后，再进行低渗处理，离心，菌体已经烂成一滩泥了！用30%（W/V）硫酸铵盐析后，没获得多少蛋白。第一次做，效果很不理想，求用过渗透冲击法的高手指导。十分感谢！！！

[ Last edited by nmgdwg on 2011-7-5 at 14:41 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼2011-07-05 14:39:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 101202139 at 2011-07-11 13:20:19:
高压破碎我也没用过，我的菌体量较少，一般用超声破碎！

那超声用什么BUFFER呢？
我这每次培养只能收集到5g左右的菌体，还得攒到20g才能 进高压，郁闷啊！
当初老师怎么就买了高压啊啊  啊啊啊，超声多方便啊
赞一下 回复此楼
10楼2011-07-13 09:03:27
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

zsy1106

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lstt09nk(金币+3): 感谢参与 2011-07-13 19:32:36
1、没获得多少蛋白的原因，恐怕不是因为你的渗透冲击法，而是本身就没表达出多少可溶状态（也就是说上清表达）的蛋白。
2、因为220KD有点超过大肠杆菌的表达能力了。即使有表达，大多也会以包涵体的形式存在。而以包涵体存在的蛋白在离心的时候已经和破碎的菌体一起存在在沉淀里了。
做这个蛋白，难度在于表达，而不是怎么裂解纯化。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-07-05 21:35:18
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nmgdwg

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zsy1106 at 2011-07-05 21:35:18:
1、没获得多少蛋白的原因，恐怕不是因为你的渗透冲击法，而是本身就没表达出多少可溶状态（也就是说上清表达）的蛋白。
2、因为220KD有点超过大肠杆菌的表达能力了。即使有表达，大多也会以包涵体的形式存在。而 ...

它是二聚体，单个亚基110KD 也很难？
赞一下 回复此楼
3楼2011-07-06 10:20:39
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zsy1106

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
nmgdwg(金币+5): 2011-07-08 13:16:10
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-07-13 19:32:51
引用回帖:
Originally posted by nmgdwg at 2011-07-06 10:20:39:
它是二聚体，单个亚基110KD 也很难？

110KD对于BL21而言，是可以表达的，但是表达量不会大，可能会有小部分表达在上清，但大部分可能是以不溶的包涵体形式存在，这个不一定，也要看你蛋白本身的性质，不知道楼主有没有拿序列去分析一下蛋白的亲疏水区域，如果亲水区域高的话，表达上清会稍稍容易一点。
楼主的蛋白是要拿来做什么的，包涵体复性的方法不知道能不能用
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-07-06 11:19:18
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭