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maggie3277木虫 (小有名气)
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【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带 已有22人参与
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| 请教各位虫友，最近做重组蛋白的表达。但在大肠杆菌内重组的pet28a总表达不出我的目标条带，IPTG诱导浓度也设置了梯度，温度也设定了梯度。但就是没有我的目标条带的生成。请问有虫友遇到过类似情况，构建好的质粒却表达不出条带的情况吗？ |
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5楼2010-07-24 09:11:43
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silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:23
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:23
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pET28a我正在是用，给出几点建议，LZ可以尝试一下： 1、对表达载体再次测序，确定整个ORF的正确性（要从载体最前端含有标签的起始位置到终止子部分）。确定载体没有问题（其他基因使用时候可以表达）； 2、441个氨基酸中有37个稀有密码子也无需大惊小怪，关键问题是只要没有两个或者三个以上稀有密码子串联出现。如果担心稀有密码子问题可以考虑使用Rosetta菌柱系列； 3、建议试诱导的条件为37℃ 1mM IPTG诱导4h。分别取诱导前和诱导后个200微升，加入40微升Loading buffer ，上样前高速离心10min。上样16-18微升，对比诱导前后有没有明显的差异条带； 4、如果上述步骤没有看到明显的差异条带，而测序显示阅读框没有任何问题，建议扩大培养。一次培养200ml-1L的菌液，使用亲和柱富集。然后从柱子上洗脱，看有没有目的蛋白。有时候表达量第，需要富集后才能看到有目的蛋白的表达。 还不行就尝试更换载体。 |
33楼2010-08-04 18:52:54
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