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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带
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maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-07-28 18:45:32:
不是吧 楼主 37个还不多啊 很多了 你把你现在的载体转到RocettaBL21里表达看看 km50再加cm25 37度先试试

另外28楼的同学 表达不表达是看基因的来源是不适合大肠杆菌 是否包涵体是看折叠过程是否正常 这是对sol ...

我的蛋白是剪切了信号肽的基因，来源不知，只知道是某细菌的一段基因片段。但是是有完整开读框的。
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31楼2010-07-28 20:04:53
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周_yan

木虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by maggie3277 at 2010-07-27 10:08:46:

恩，现在已经又送去测序啦！还不知道结果怎么样。

现在测序结果应该出来了吧，怎么样啊？有没有终止密码子？
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32楼2010-08-04 10:06:54
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:23
pET28a我正在是用，给出几点建议，LZ可以尝试一下：
1、对表达载体再次测序，确定整个ORF的正确性（要从载体最前端含有标签的起始位置到终止子部分）。确定载体没有问题（其他基因使用时候可以表达）；
2、441个氨基酸中有37个稀有密码子也无需大惊小怪，关键问题是只要没有两个或者三个以上稀有密码子串联出现。如果担心稀有密码子问题可以考虑使用Rosetta菌柱系列；
3、建议试诱导的条件为37℃ 1mM IPTG诱导4h。分别取诱导前和诱导后个200微升，加入40微升Loading buffer ，上样前高速离心10min。上样16-18微升，对比诱导前后有没有明显的差异条带；
4、如果上述步骤没有看到明显的差异条带，而测序显示阅读框没有任何问题，建议扩大培养。一次培养200ml-1L的菌液，使用亲和柱富集。然后从柱子上洗脱，看有没有目的蛋白。有时候表达量第，需要富集后才能看到有目的蛋白的表达。
    还不行就尝试更换载体。
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33楼2010-08-04 18:52:54
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maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 周_yan at 2010-08-04 10:06:54:




现在测序结果应该出来了吧，怎么样啊？有没有终止密码子？

序列是没问题的。
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34楼2010-08-05 11:17:32
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xingxing342

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我用PET-28 PET-30都没表达出来，用PGEX就可以，但PGEX标签太大。
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35楼2010-08-10 10:14:25
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:35
可能你的基因根本不在Ecoli表达。但是要回答这个问题，你首先要确定：
1.测序是否正确？
2.即使有信号肽，标签是在N-terminal or C-terminal，如果前者，应该不会分泌表达。
3.是否是沉淀？
如果不是，可以考虑用GST-tag的标签，GST比较大，蛋白得可溶性和可表达性都会增加（这个原理貌似大的标签使蛋白在翻译的时候很容易通过，这个只是别人的经验）
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36楼2010-08-10 10:27:00
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noheartman

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
遇到过这样的情况，你以为连接到表达载体上就表达啊，不是这样的，要尝试不同的载体、不同的表达菌株及优化表达条件，后面的天地还宽着呢！
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37楼2010-08-10 15:31:35
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mengyu615

金虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你重组的目的基因是什么，片段有多长呢？？
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希望结识更多的你們。。。
38楼2010-09-19 10:50:51
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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lz
时隔一年 你的蛋白表达出来了嘛？

我最近开始的蛋白诱导表达，
一共两个，诱导出一个，另外一个换了含稀有密码子的菌株还没诱导表达出来，， 你的稀有密码子含量有8.4% 应该算比较高的了，
我想尝试做自诱导了，，但是我们实验室都没有人做过，那些培养基所需要的成分，我们实验室基本没有的，再问师兄买东西，估计，，，，哎，，
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39楼2011-11-21 16:41:53
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-11-22 10:46:44
引用回帖:
8楼: Originally posted by maggie3277 at 2010-07-24 12:52:45:
我是用Signal P预测的，然后将序列的信号肽去除连接上表达载体的，这个会影响蛋白的表达嘛？
我就是表达个蛋白测酶活的，蛋白也不是很大的。
[ Last edited by maggie3277 on 2010-7-24 at 12:54 ]

去掉是对的。去掉更好。

诱导时候加入cam。
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
40楼2011-11-21 19:59:11
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