| 查看: 4838 | 回复: 41 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
maggie3277木虫 (小有名气)
|
[交流]
【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带 已有22人参与
|
||
| 请教各位虫友，最近做重组蛋白的表达。但在大肠杆菌内重组的pet28a总表达不出我的目标条带，IPTG诱导浓度也设置了梯度，温度也设定了梯度。但就是没有我的目标条带的生成。请问有虫友遇到过类似情况，构建好的质粒却表达不出条带的情况吗？ |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有192人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
月月大可
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 3
- 应助: 13 (小学生)
- 金币: 3272.1
- 散金: 1393
- 红花: 17
- 帖子: 1674
- 在线: 295.7小时
- 虫号: 549127
- 注册: 2008-04-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:23
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-09-19 12:43:23
|
pET28a我正在是用，给出几点建议，LZ可以尝试一下： 1、对表达载体再次测序，确定整个ORF的正确性（要从载体最前端含有标签的起始位置到终止子部分）。确定载体没有问题（其他基因使用时候可以表达）； 2、441个氨基酸中有37个稀有密码子也无需大惊小怪，关键问题是只要没有两个或者三个以上稀有密码子串联出现。如果担心稀有密码子问题可以考虑使用Rosetta菌柱系列； 3、建议试诱导的条件为37℃ 1mM IPTG诱导4h。分别取诱导前和诱导后个200微升，加入40微升Loading buffer ，上样前高速离心10min。上样16-18微升，对比诱导前后有没有明显的差异条带； 4、如果上述步骤没有看到明显的差异条带，而测序显示阅读框没有任何问题，建议扩大培养。一次培养200ml-1L的菌液，使用亲和柱富集。然后从柱子上洗脱，看有没有目的蛋白。有时候表达量第，需要富集后才能看到有目的蛋白的表达。 还不行就尝试更换载体。 |
33楼2010-08-04 18:52:54
小白3521
金虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 690.8
- 散金: 218
- 帖子: 251
- 在线: 73.8小时
- 虫号: 769519
- 注册: 2009-05-13
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2010-07-23 23:28:47
lwiaanngg
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 46 (小学生)
- 贵宾: 0.773
- 金币: 7403.2
- 散金: 24
- 红花: 12
- 帖子: 1211
- 在线: 110.3小时
- 虫号: 43541
- 注册: 2004-04-10
- 专业: 应用高分子化学与物理
3楼2010-07-24 00:11:56
sunyongle1
木虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2638.8
- 散金: 1
- 帖子: 413
- 在线: 103.8小时
- 虫号: 1059232
- 注册: 2010-07-17
- 专业: 肿瘤发生
4楼2010-07-24 08:04:55
