应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白诱导表达不出目标条带
423/5返回列表上一页12345下一页
查看: 4669  |  回复: 41
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liyong1981 at 2010-07-26 14:24:44:
做什么原核呢，~啊~

啊？大肠杆菌……
回复此楼
21楼2010-07-27 10:09:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-07-26 21:14:35:
当然有这种情况了 不表达 换一下载体 用MAL融合看看
这是蛋白异源表达性质决定的 楼主你确定你的测序 读码和连接没问题的情况下 与诱导时间和表达温度都无关的

恩，同感，再不行，我就要重新构建啦！
得研究下融合表达的相关知识了，以前没做过。
赞一下 回复此楼
22楼2010-07-27 10:12:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-27 23:37:03
一样的 融合是自动的 只是切切连连再构建个质粒而已 pET系列就有 pET多少我忘了 Nus MAL和GST都可以试试看
目标蛋白如果表达 大小就变了 是增加后的大小
37度诱导的上个对照看就行 不用marker
赞一下(2人) 回复此楼
Bemühen Sie !
23楼2010-07-27 10:51:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-27 23:37:10
对了 分析稀有密码子了么？ 你的基因是什么生物来源的？ 分析一下大肠的密码子 实在不行用现在的construct转一下Rocetta

是一点不表达还是表达出来大小长短不对短一截？
赞一下(1人) 回复此楼
Bemühen Sie !
24楼2010-07-27 10:53:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-27 23:37:40
楼主啊 你还没测完序BLAST就先把载体构建啦 别着急么 测完序BLAST功能了再说
你确定你克隆到的已经是一个基因没有其他序列了？
16楼的同学 刚看到 是2k吧 2千k没这么大的基因 2k不是很大 蛋白八九十kD吧
我想问16楼的同学 小了几kD是怎么看出来的？
2k基因一般对应八九十kD的蛋白 跑PAGE怎么看出来只小了几kD
目标蛋白只要和诱导的对照对上了 和Marker稍有偏差是没关系的 除非质谱或蛋白测序才能较精确的定分子量
赞一下(2人) 回复此楼
Bemühen Sie !
25楼2010-07-27 10:59:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by chemifunan at 2010-07-27 10:53:04:
对了 分析稀有密码子了么？ 你的基因是什么生物来源的？ 分析一下大肠的密码子 实在不行用现在的construct转一下Rocetta

是一点不表达还是表达出来大小长短不对短一截？

441个氨基酸含有37个稀有密码子的氨基酸残基，也不是太高吧？
赞一下 回复此楼
26楼2010-07-27 19:26:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

刘小乐

铜虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-27 23:37:52
1、还是先试试其他质粒吧，我也觉得28不怎么好的 ；
2、受体菌可以换用稀有密码子补加（plus）的菌种看看效果
赞一下(1人) 回复此楼
互动互利互相学习
27楼2010-07-27 19:39:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

noheartman

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+3):谢谢交流！:tiger06: 2010-07-27 23:38:00
构建好的表达载体在大肠杆菌中不一定会表达的，就算你优化表达时间，IPTG的浓度或其他的，我做的是膜蛋白，pET28a就不怎么表达，或者以包涵体的形式表达。你可以试着进行一些N末端的修饰，看看有没有一定的效果。不过总的来说，通过优化表达条件基本是行不通的，换个载体也许行。
赞一下(2人) 回复此楼
28楼2010-07-27 21:58:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maggie3277

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by noheartman at 2010-07-27 21:58:57:
构建好的表达载体在大肠杆菌中不一定会表达的，就算你优化表达时间，IPTG的浓度或其他的，我做的是膜蛋白，pET28a就不怎么表达，或者以包涵体的形式表达。你可以试着进行一些N末端的修饰，看看有没有一定的效果。 ...

再不行的话，真的要换载体了，我要抓狂了。
赞一下 回复此楼
29楼2010-07-28 09:29:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chemifunan

木虫 (正式写手)

海王小木虫
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不是吧 楼主 37个还不多啊 很多了 你把你现在的载体转到RocettaBL21里表达看看 km50再加cm25 37度先试试

另外28楼的同学 表达不表达是看基因的来源是不适合大肠杆菌 是否包涵体是看折叠过程是否正常 这是对soluble蛋白
膜蛋白比较特殊 即使折叠正确也会沉淀 膜蛋白是大肠来源的同源高表达最好做 表达完了会附着在自己的膜上 高速离心分离 如果其他来源的 会直接是包涵体 把包涵体分出来 溶在相应的detergent溶液里就好了

N端保守型高一点 通常N端折叠不正常会导致整个蛋白表达效果失败 看楼主的基因是什么来源了 有些基因表达后在宿主内有后修饰 大肠不具备就不会很好表达

现今策略 试试pMAL等融合载体 再就是原有载体换个菌种 用rocetta看看

另外问一下 楼主你的基因是完整的基因还是truncated的基因
赞一下(1人) 回复此楼
Bemühen Sie !
30楼2010-07-28 18:45:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 maggie3277 的主题更新
423/5返回列表上一页12345下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭