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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金币+4): 2011-07-25 20:13:40
正在做这方面实验,你的情况说的不是很清楚。
1,通过别的手段鉴定是否表达,如构建的克隆基因有某方面功能可以直接用于筛选。我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功,底物浓度从0-0.5,平板抗性梯度很明显~
2,菌体PCR或者提质粒PCR验证,提质粒酶切验证。
3,测序。
把前期工作做好,然后开始诱导表达。
4,蛋白电泳
    诱导浓度:IPTG诱导过夜诱导,浓度0.5mM,37℃,在加IPTG诱导的同时加0.1M的底物增大选择压力。
5,离心除去菌液上清,加PBS,菌体超声破碎,一部分离心分为破碎上清和沉淀,一部分跑全蛋白。理论上膜蛋白跑全蛋白就行。
6,优化诱导条件。括温度、时间等。你可以搜索一下论坛,很多这方面的帖子。
2楼2011-07-25 16:52:24
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 很有条理,再次奖励! 2011-07-25 23:27:35
就是从得到该基因,克隆至载体,转化大肠杆菌TransT1,提质粒再次转化目的菌株,然后做抗性梯度验证这个过程。
我做的是某氨基酸输出蛋白,是一种膜蛋白,约200aa,抗性梯度很漂亮,涉及专利。因为表达这个输出蛋白,肯定会引起菌体对该氨基酸有较大抗性,所以使用含有不同浓度该氨基酸的平板验证是否有抗性。我已经验证出2个基因了。
还是有些问题的。
1,如果某一个pET不表达,一系列的pET可能都不表达,有些人这么认为,我没有经历过,供你参考。为什么pET不表达,这个。。。好难啊,我也不知道。
2,膜蛋白确定可以表达?某些基因难表达,或不表达~我去,这个,有点难以接受啊,有相关资料吗?可以查一下。
3,原核生物的膜蛋白合不合适BL21表达。
如果是上述原因,建议换基因,换载体。
4,得到蛋白质序列,做密码子优化。这一步或许可以解决很多问题。因为某原核膜蛋白密码子肯定不同于大肠杆菌密码子,我做的这个膜蛋白是通过基因合成的方式得到的:NCBI得到蛋白质序列——根据宿主(大肠杆菌)优化密码子(优化后的密码子NCBI比对跟原核酸序列没有任何相关性)——克隆表达,有用rosetta(de3菌株)的,可以表达稀有密码子。
5,western blot 看是不是真的木有表达。
6,有木有异源信号肽?膜蛋白信号肽可能影响表达。
7,有木有可能是二聚体或多聚体,你再看看?
8,突变造成的终止或不表达,pET载体突变造成的不表达也不能排除(转化到pET后测序正确可以排除这个)。
9,优化各种条件,甚至包括培养条件,摇床转速,诱导时间,诱导温度。

纠结的膜蛋白~
7楼2011-07-25 23:05:37
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