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膜蛋白表达问题
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我最近在做原核生物的膜蛋白在大肠杆菌中的表达，大致是将目的基因克隆到pET-30a的表达载体上，然后转化到BL21-DE3的感受态细胞中，诱导表达，通过SDS-PAGE电泳，观察结果。可是现在的问题是根本就没有目的蛋白条带，所以求有经验的虫友们不吝赐教。不胜感激…… |
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 【分子生物】EPI帖 |
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gwbk
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 很有条理，再次奖励！ 2011-07-25 23:27:35
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 很有条理，再次奖励！ 2011-07-25 23:27:35
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就是从得到该基因，克隆至载体，转化大肠杆菌TransT1，提质粒再次转化目的菌株，然后做抗性梯度验证这个过程。 我做的是某氨基酸输出蛋白，是一种膜蛋白，约200aa，抗性梯度很漂亮，涉及专利  。因为表达这个输出蛋白，肯定会引起菌体对该氨基酸有较大抗性，所以使用含有不同浓度该氨基酸的平板验证是否有抗性。我已经验证出2个基因了。还是有些问题的。 1，如果某一个pET不表达，一系列的pET可能都不表达，有些人这么认为，我没有经历过，供你参考。为什么pET不表达，这个。。。好难啊，我也不知道。 2，膜蛋白确定可以表达？某些基因难表达，或不表达~我去，这个，有点难以接受啊，有相关资料吗？可以查一下。 3，原核生物的膜蛋白合不合适BL21表达。 如果是上述原因，建议换基因，换载体。 4，得到蛋白质序列，做密码子优化。这一步或许可以解决很多问题。因为某原核膜蛋白密码子肯定不同于大肠杆菌密码子，我做的这个膜蛋白是通过基因合成的方式得到的：NCBI得到蛋白质序列——根据宿主（大肠杆菌）优化密码子（优化后的密码子NCBI比对跟原核酸序列没有任何相关性）——克隆表达，有用rosetta（de3菌株）的，可以表达稀有密码子。 5，western blot 看是不是真的木有表达。 6，有木有异源信号肽？膜蛋白信号肽可能影响表达。 7，有木有可能是二聚体或多聚体，你再看看？ 8，突变造成的终止或不表达，pET载体突变造成的不表达也不能排除（转化到pET后测序正确可以排除这个）。 9，优化各种条件，甚至包括培养条件，摇床转速，诱导时间，诱导温度。 纠结的膜蛋白~ |
7楼2011-07-25 23:05:37
gwbk
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金币+4): 2011-07-25 20:13:40
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金币+4): 2011-07-25 20:13:40
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正在做这方面实验，你的情况说的不是很清楚。 1，通过别的手段鉴定是否表达，如构建的克隆基因有某方面功能可以直接用于筛选。我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功，底物浓度从0-0.5，平板抗性梯度很明显~ 2，菌体PCR或者提质粒PCR验证，提质粒酶切验证。 3，测序。 把前期工作做好，然后开始诱导表达。 4，蛋白电泳 诱导浓度：IPTG诱导过夜诱导，浓度0.5mM，37℃，在加IPTG诱导的同时加0.1M的底物增大选择压力。 5，离心除去菌液上清，加PBS，菌体超声破碎，一部分离心分为破碎上清和沉淀，一部分跑全蛋白。理论上膜蛋白跑全蛋白就行。 6，优化诱导条件。括温度、时间等。你可以搜索一下论坛，很多这方面的帖子。 |
2楼2011-07-25 16:52:24
gwbk
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3楼2011-07-25 19:40:39
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首先，克隆肯定是没有问题的。酶切验证过，而且也测过序列，完全正确。 其次，在诱导表达蛋白时，我的膜蛋白A大小是37.5KD，跑SDS-PAGE，发现有差不多大小的蛋白，另外我又做了膜蛋白B的表达（目的大小是53.1ＫＤ），跑SDS-PAGE，没有目的条带，而且发现膜蛋白A的胶图与膜蛋白B的胶图很类似。所以很有可能是我的表达系统的问题，下一步就选择一种普通的蛋白作为对照，发现膜蛋白A的目的大小条带也在普通蛋白胶图上。总而言之，膜蛋白A、膜蛋白B在表达宿主菌中均没有表达。不知道是什么情况？ 最后，你说的“我现在做的从克隆构一直做到抗性筛选成功，底物浓度从0-0.5，平板抗性梯度很明显~”这句话没有太明白。我的目的基因没有某方面的功能。 本人是新手，还望多多指点…… |
4楼2011-07-25 20:13:03
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