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pplu0329

木虫 (正式写手)

[求助] 蛋白表达不明确，但是连菌体蛋白都不见

我用50ul菌液加入5mlLB培养基中，摇菌扩增16h后按2%比例转接到200mlLB培养基中，摇2h后加入IPTG诱导表达4h，收菌跑胶，可是泳道上连菌体蛋白都看不见？请教下是什么情况？
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1楼 2012-02-14 11:15:05
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是噬菌体的原因啊
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2楼2012-02-14 13:26:14
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pplu0329

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihuan0525 at 2012-02-14 13:26:14:
是不是噬菌体的原因啊

请教前辈，我是第一次做这个，其中氨苄及氯霉素均按照比例加入，您说的噬菌体又是什么情况呢？
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3楼2012-02-15 23:17:31
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

pplu0329(金币+2): ★★★很有帮助 2012-02-16 19:28:38
噬菌体就是专门吃细菌的，具体怎么消除我也不知道，可能百度里有吧
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4楼2012-02-16 08:30:31
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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看天(金币+3): 鼓励回答 2012-03-01 15:25:59
1. 加入IPTG诱导表达4h后菌液是比较澄清的还是很浑浊了？有的菌长的比较慢，量少的话可能检测不出来，特别是当你用低灵敏度的染胶溶液。
2. 目的蛋白表达不是随便找个菌就可以诱导表达的，因为有的目的蛋白具有毒性，需要选择合适的宿主进行表达。
3. 你选择的宿主菌确定具有氨苄及氯霉素抗性么？
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5楼2012-02-17 11:22:54
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pplu0329

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-17 11:22:54:
1. 加入IPTG诱导表达4h后菌液是比较澄清的还是很浑浊了？有的菌长的比较慢，量少的话可能检测不出来，特别是当你用低灵敏度的染胶溶液。
2. 目的蛋白表达不是随便找个菌就可以诱导表达的，因为有的目的蛋白具有毒 ...

1.加入IPTG4H后菌液是浑浊的。
2.我的目的蛋白之前请老师做的时候都是很成熟的了
3.确定是有这两种抗性的
谢谢这位前辈的意见，您看我这样应该怎么调整？另，能否推荐一些入门的蛋白表达纯化和抗体制备的书？
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6楼2012-02-17 22:30:36
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若水5886

新虫 (小有名气)
★ ★
看天(金币+2): 鼓励交流 2012-03-01 15:26:11
引用回帖:
6楼: Originally posted by pplu0329 at 2012-02-17 22:30:36:
1.加入IPTG4H后菌液是浑浊的。
2.我的目的蛋白之前请老师做的时候都是很成熟的了
3.确定是有这两种抗性的
谢谢这位前辈的意见，您看我这样应该怎么调整？另，能否推荐一些入门的蛋白表达纯化和抗体制备的书？

如果是之前已经做出来蛋白过,那这次跑胶连菌体蛋白都没有可能是你上样量不够吧?另外菌体上样前做过什么处理么?没有让蛋白变性沉淀吧?要是蛋白被加热或者其它操作给弄变性了沉淀了,你加入上清上样什么都没有的.蛋白表达的相关内容你网上搜搜看就行了,好象有本<抗体制备与使用实验指南>,你可以看看.
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7楼2012-02-18 15:42:41
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pplu0329

木虫 (正式写手)
回答前辈的问题，我在收取菌液样本后，按照实验步骤在1ml样本离心沉淀中加入50ul纯水和50ul2*buffer，煮蛋白5分钟，10ul上样跑胶的，其中有个问题就是在溶解沉淀的时候液体很粘稠，我吸取样品的时候可能没有在粘稠的位置吸取，一方面是不是就是没有吸到有蛋白的地方，另一方面是不是我已经让蛋白变性了？不能煮，直接上样么？请指教。
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8楼2012-02-18 23:09:24
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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看天(金币+2): 鼓励回答 2012-03-01 15:26:22
pplu0329(金币+1): ★有帮助 2012-03-01 16:32:04
个人觉得你处理样品有问题，你试试离心后弃上清，将沉淀用buffer充分悬浮后再加热，至少10分钟吧。加热后的样品不应该粘稠的。应该和MARKER是差不多状态。最多会有点沉淀。
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9楼2012-03-01 11:09:25
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by pplu0329 at 2012-02-18 23:09:24:
回答前辈的问题，我在收取菌液样本后，按照实验步骤在1ml样本离心沉淀中加入50ul纯水和50ul2*buffer，煮蛋白5分钟，10ul上样跑胶的，其中有个问题就是在溶解沉淀的时候液体很粘稠，我吸取样品的时候可能没有在粘稠 ...

粘稠是因为你直接煮菌液让里面的核酸都跑出来了，可以加点核酸降解酶作用一段时间就看见变得清澈透亮了。建议你跑胶的时候即使是随便看看也要加marker，如果marker有条带而菌液没有条带，那可能是上样蛋白量不够或者是之前操作有问题；如果连marker也没有条带那就可能是胶的问题了吧
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10楼2012-03-01 16:07:09
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