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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 急！蛋白截短表达不成功~
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 急！蛋白截短表达不成功~

情况是这样的：我本来要表达一个蛋白，但是由于比较大，不容易表达（也是没做出来），因此我就选N末端（疏水性）进行表达。因为这一段前面还有信号肽，因此把这一段截出来的话我就人为在前面加上ATG以及在后面加上TGA。现在经过测序已经正确的连接到表达载体上了，但是还是没有表达（用SDS-PAGE作为检测手段），各位有做过蛋白截短表达嘛？请帮忙找一下原因，谢谢！！也做了比较久了，各位帮帮忙~~
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1楼 2011-11-13 20:11:32
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sl35537417

木虫 (正式写手)
没有表达还是形成包涵体？
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2楼2011-11-13 20:31:54
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kokia

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流！ 2011-11-14 16:41:06
基因来源和宿主表达系统可能不匹配。有时候也是没办法，我一个师弟做过这个，分了三段，两段表达，一段不表达。我们实验室表达系统较少，所以没有继续做，你可以试一下别的表达系统，或者载体，宿主换几种试一下。
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3楼2011-11-13 22:09:13
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sl35537417 at 2011-11-13 20:31:54:
没有表达还是形成包涵体？

就直接将菌体煮裂上样的，所以应该是没有表达
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4楼2011-11-14 09:00:47
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
wanhscn: 及时给3楼发部分悬赏 2011-11-15 17:28:24
引用回帖:
3楼: Originally posted by kokia at 2011-11-13 22:09:13:
基因来源和宿主表达系统可能不匹配。有时候也是没办法，我一个师弟做过这个，分了三段，两段表达，一段不表达。我们实验室表达系统较少，所以没有继续做，你可以试一下别的表达系统，或者载体，宿主换几种试一下。

用的是ｐＥＴ系统，有没有什么好的推荐？
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5楼2011-11-14 09:01:13
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
自己再顶一下！
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6楼2011-11-15 08:50:30
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
自己再顶一下，实在不行就换表达载体了
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7楼2011-11-18 10:23:30
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): Good！鼓励应助！ 2011-11-18 19:27:27
shenxing325(金币+20): 因为我实验室里只有我一个人做这个方面更，其他人都不相关，所以自己摸索得还不够，可以和你继续交流吗？你提供的信息对我很重要，谢谢！ 2011-11-19 10:38:05
我看楼主的专业像是做蛋白结构的，我和你也算是同行。我们实验室做截短表达从来都不是像你这样只做一个。

有些蛋白很难获得可溶性表达，所以通常采用的就是truncation。对于一些我们真正感兴趣的蛋白，为了筛到可溶性表达，我们都是几个氨基酸残基这样一步一步截短，做不同的N,C端截短组合，几百个克隆这样做。我还没听说过楼主这样的截短策略——盯住一个。

另外，在做截短之前需要对自己的蛋白二级结构做很多判断，比如存不存在disorder，哪些domain是真正重要的等等。

最后祝你试验顺利。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
8楼2011-11-18 12:49:13
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AnkeyGO

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主用何种方法破碎细胞？建议用超声波破碎
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9楼2011-11-18 18:44:53
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