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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达系统不表达目的蛋白
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rainontime

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达系统不表达目的蛋白

将含有目的片段的质粒转入BL21，诱导表达后发现没有目的蛋白，这是为什么？
1酶切实验证明质粒中有目的片段
2测序表明没有移码突变，序列没有问题，没有提前终止
谢谢！
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1楼 2011-10-14 09:33:03
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poog502

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): Good！热心！专业！ 2011-10-14 18:01:03
rainontime(金币+1): 2011-10-17 09:06:12
rainontime(金币+1): 2011-10-17 09:07:13
原因有二：
1、诱导条件。蛋白的表达要考虑诱导时间、温度、IPTG浓度等，任何一个都会造成不表达或之所以检测不到，可能是诱导的蛋白已经降解。
2、载体问题。并非每个蛋白都适合在E. coli BL21中表达，需要尝试，找到最佳表达载体。
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2楼2011-10-14 13:50:50
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): Good！ 2011-10-14 18:01:25
rainontime(金币+1): 2011-10-17 09:06:22
对楼上的答案很赞，补充一些：
1、首先确认一下该载体在E.coli里边是否能表达，避免无谓的尝试和浪费，可以询问实验室前辈或者网上查询求助；
2、载体没问题的前提下，一般诱导条件设置： TPTG终浓度为1mM/ml（如果有诱导后死菌情况可以适当降低浓度）；诱导温度37、28、16诱导的都有，一般想要得到溶合蛋白是要低温诱导的；相应的诱导时间 37度（6-8h）、28度（过夜诱导）、16度（过夜诱导），自己尝试着摸最佳条件
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
3楼2011-10-14 14:44:39
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li1977li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-14 18:01:31
还可以换表达宿主菌Rosetta试试，我们实验室用它来表达至今还未失过手。
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4楼2011-10-14 15:09:57
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poog502

木虫 (正式写手)
★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-16 10:50:16
引用回帖:
3楼: Originally posted by xbl3688 at 2011-10-14 14:44:39:
对楼上的答案很赞，补充一些：
1、首先确认一下该载体在E.coli里边是否能表达，避免无谓的尝试和浪费，可以询问实验室前辈或者网上查询求助；
2、载体没问题的前提下，一般诱导条件设置： TPTG终浓度为1mM/ml（ ...

这个诱导的时间很重要的，曾在BL21中诱导花器官发育蛋白37℃半小时即可表达，2小时后降解完全。
建议按照正交实验设计相应的参数。
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5楼2011-10-16 08:49:16
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

楼上提及的都要考虑，此外还有稀有密码子的问题要考虑；
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致良知
6楼2011-10-16 09:29:23
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dasheng1980

铁杆木虫 (知名作家)

大圣

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励交流！ 2011-12-11 17:53:21
同意1楼和2楼的说法，不知道你的诱导条件和温度、PH有关没，但一般用IPTG诱导的都和其浓度有关，另外诱导时间也很关键，诱导晚了有的就不表达了。
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dasheng1980
7楼2011-12-11 08:57:33
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果断悉尼

铁杆木虫 (知名作家)

三沙市名誉常务副市长

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
rainontime(金币+2): 2012-01-17 14:04:20
撇开诸位所讲的 会不会是你的蛋白太小 跑胶看不到 ；
WB检测下是否表达
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我的微信号happyjk5208，谢绝闲聊
8楼2011-12-13 10:19:35
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若水5886

新虫 (小有名气)
1. 看你的目的蛋白是不是毒性蛋白，如果是毒性的需要在特殊的表达宿主里表达。
2. 诱导的条件要优化。
3. 诱导表达的蛋白是可溶性的还是以包涵体形式存在的？如果是包涵体形式表达或者是表达条件不合适使蛋白以包涵体形式存在的话，要检测菌沉淀而不是上清
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9楼2012-02-17 17:26:08
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