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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达做不出来了！
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 原核表达做不出来了！

去年构建了重组菌做原核表达，载体是pET28a，宿主菌是BL21，诱导都能得到高浓度的蛋白，之前只是纠结纯化结果不是很理想，谁知道最近一个多月，做了很多次表达，都不能表达出目的蛋白，送测序又没有问题，快崩溃了！
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2013-06-06 09:02:31
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-06 11:46:34
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-06-07 23:33:34
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-06-07 23:36:53
重新转化一下，你的细胞，千万别使用错细胞一定是DE3溶源菌。这种情况很少的，哪有之前可以表达现在不能表达啊。
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2楼2013-06-06 10:01:29
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Bio海盗路飞

木虫 (小有名气)
是不是诱导剂出问题了？
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努力工作，让自己每天都能进步!
3楼2013-06-06 15:55:42
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-06-07 23:30:56
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-10 16:59:12
有可能是渗漏表达的影响，重新提质粒、转化，再进行表达。
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小兵一个
4楼2013-06-06 16:50:06
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applewxy

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+1, ★有帮助 2013-06-07 23:29:03
本帖内容被屏蔽
5楼2013-06-07 09:22:54
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dcb005

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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sxxuan: 金币+2, ★有帮助 2013-06-07 23:28:49
做个对照看看是不是IPTG诱导有问题，还有是不是你的stock中质粒丢失了
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
6楼2013-06-07 16:16:21
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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sxxuan: 金币+2, ★有帮助 2013-06-07 23:27:34
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-10 16:59:23
可以换个感受态细胞重新转化一下试试，或者看看结构两端是否有对结构、功能没有影响到序列截去，在表达试试。有很多蛋白不好纯化，我有2个蛋白两年多了还没能很好的纯化出来。
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7楼2013-06-07 16:52:49
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zx1984 at 2013-06-07 16:52:49
可以换个感受态细胞重新转化一下试试，或者看看结构两端是否有对结构、功能没有影响到序列截去，在表达试试。有很多蛋白不好纯化，我有2个蛋白两年多了还没能很好的纯化出来。

我只有两种BL21，因为现在用的一直都没问题所以就没有试过另外一种。我也是打算抽提质粒重新转化看看
怎么看结构？因为测序没问题，所以我一直没有考虑这方面的问题
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你的日子如何，你的力量也必如何！
8楼2013-06-07 23:27:18
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dcb005 at 2013-06-07 16:16:21
做个对照看看是不是IPTG诱导有问题，还有是不是你的stock中质粒丢失了

请问怎么设对照？是拿别的重组菌做对照吗？
菌株测序没问题，是否也是会存在质粒丢失的情况？
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你的日子如何，你的力量也必如何！
9楼2013-06-07 23:28:44
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by linxt2005 at 2013-06-06 16:50:06
有可能是渗漏表达的影响，重新提质粒、转化，再进行表达。

请问什么是渗漏表达？很惭愧虽然做这一块很久了，但一直停留在操作水平上，对原理其实还是很不懂，特别是遇到问题的时候就不知道怎么分析了
之前也是听说过重新转化就好了，请问这可能是什么原因？老板问起来的时候回答得很心惊胆战啊
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你的日子如何，你的力量也必如何！
10楼2013-06-07 23:30:49
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