应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达中目的蛋白不明确
81/1返回列表
查看: 1348  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

麦堂straw

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达中目的蛋白不明确

初做蛋白表达，目的片段确定插入载体测序正确，用的BL21为宿主菌，尝试了各种条件，比如IPTG浓度有0.1mM、0.5mM、1mM，温度有37，30，25，蛋白电泳结果分析均无明显目的条带，虽在Marker相近位置处有条带表达，但未诱导前也有该条带的表达，且诱导后条带浓度的增加量并不是十分明显，所以很纠结到底是不是想要的目的条带。
请问各位大虾，碰到这种情况，要怎么办？我的蛋白带了His标签，如果我做镍柱纯化的话可否验证条带的正确性，我怕如果那条条带就算是目的条带的话，表达量太少我一纯化损失太多也看不到，求助我该如何处理？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
1楼 2012-05-25 22:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 辛苦哈 2012-05-26 10:54:49
麦堂straw: 金币+1, 谢谢应助 2012-05-28 09:06:19
首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-26 08:20:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦堂straw

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-26 08:20:48
首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。

谢谢回复。
已确认外源基因转入载体且测序正确，现在不确定的是外源基因有没有表达，因为条带不明显，像是又不像是目的条带，所以想通过纯化看一下，就是怕本来表达量少再一纯化就没了，也鉴别不了到底是不是要表达的条带了。
赞一下 回复此楼
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
3楼2012-05-26 22:22:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

damaomao

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw: 金币+1, 谢谢应助 2012-05-28 09:06:38
本帖内容被屏蔽
4楼2012-05-27 09:32:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ruoshui183

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 十分有帮助 2012-05-28 09:05:47
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2012-05-27 13:04:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ruoshui183 at 2012-05-27 13:04:44
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。
...

这个方法非常的棒！！
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-27 22:10:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦堂straw

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ruoshui183 at 2012-05-27 13:04:44
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。
...

谢谢。
打算按这种方法试一下，还想请教一下低浓度咪唑破碎液具体成分是什么？做蛋白表达没多久，每次都是直接用PBS洗了再加PBS溶解拿去破碎。还有留下的胶是直接用上样缓冲液混匀跑电泳吧？
再次感谢大虾相助！
赞一下 回复此楼
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
7楼2012-05-28 09:03:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

radium4046

铁虫 (初入文坛)
western blot检测一下就行了……
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-28 15:41:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 麦堂straw 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 308求调剂 +3 是Lupa啊 2026-03-16 3/150 2026-03-16 10:07 by 求调剂zz
[考研] 311求调剂 +6 冬十三 2026-03-15 6/300 2026-03-16 08:00 by wang_dand
[考研] 中科院材料273求调剂 +3 yzydy 2026-03-15 3/150 2026-03-15 21:15 by ms629
[考研] 22408总分284求调剂 +3 InAspic 2026-03-13 3/150 2026-03-15 11:10 by zhq0425
[考研] 材料专硕326求调剂 +4 墨煜姒莘 2026-03-15 4/200 2026-03-15 11:02 by dyw
[考研] 求调剂 +3 清风问长安 2026-03-09 3/150 2026-03-14 02:15 by JourneyLucky
[考研] 0856材料与化工309分求调剂 +6 ZyZy…… 2026-03-10 6/300 2026-03-14 00:38 by JourneyLucky
[考研] 311求调剂 +5 牛乳糖的卡卡 2026-03-10 5/250 2026-03-14 00:05 by JourneyLucky
[考研] 材料工程,326分，求调剂 +6 KRSLSR 2026-03-10 6/300 2026-03-13 23:47 by JourneyLucky
[考研] 290求调剂 +9 ADT 2026-03-11 9/450 2026-03-13 21:55 by JourneyLucky
[考研] 0703化学一志愿211 总分320求调剂 +5 玛卡巴卡啊哈 2026-03-11 5/250 2026-03-13 21:40 by JourneyLucky
[考研] （081700）化学工程与技术-298分求调剂 +12 11啦啦啦 2026-03-11 35/1750 2026-03-13 21:25 by JourneyLucky
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 一志愿211化学学硕310分求调剂 +8 努力奋斗112 2026-03-12 9/450 2026-03-13 15:41 by JourneyLucky
[考研] 285求调剂 +4 ytter 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:48 by jxchenghu
[考研] 材料301分求调剂 +5 Liyouyumairs 2026-03-12 5/250 2026-03-13 14:42 by JourneyLucky
[考研] 08食品或轻工求调剂，本科发表3篇sci一区top论文，一志愿南师大食品科学与工程 +3 我是一个兵， 2026-03-10 3/150 2026-03-13 10:21 by Yuyi.
[考研] 283求调剂，材料、化工皆可 +8 苏打水7777 2026-03-11 10/500 2026-03-13 09:06 by Linda Hu
[考研] 调剂 +5 呵唔哦豁 2026-03-10 5/250 2026-03-10 22:00 by 28375m
[考研] 327分求调剂086 +4 西红柿?小帅 2026-03-09 7/350 2026-03-10 14:47 by ruiyingmiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭