应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达中目的蛋白不明确
81/1返回列表
查看: 1349  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

麦堂straw

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达中目的蛋白不明确

初做蛋白表达，目的片段确定插入载体测序正确，用的BL21为宿主菌，尝试了各种条件，比如IPTG浓度有0.1mM、0.5mM、1mM，温度有37，30，25，蛋白电泳结果分析均无明显目的条带，虽在Marker相近位置处有条带表达，但未诱导前也有该条带的表达，且诱导后条带浓度的增加量并不是十分明显，所以很纠结到底是不是想要的目的条带。
请问各位大虾，碰到这种情况，要怎么办？我的蛋白带了His标签，如果我做镍柱纯化的话可否验证条带的正确性，我怕如果那条条带就算是目的条带的话，表达量太少我一纯化损失太多也看不到，求助我该如何处理？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
1楼 2012-05-25 22:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 辛苦哈 2012-05-26 10:54:49
麦堂straw: 金币+1, 谢谢应助 2012-05-28 09:06:19
首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-26 08:20:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦堂straw

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-26 08:20:48
首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。

谢谢回复。
已确认外源基因转入载体且测序正确，现在不确定的是外源基因有没有表达，因为条带不明显，像是又不像是目的条带，所以想通过纯化看一下，就是怕本来表达量少再一纯化就没了，也鉴别不了到底是不是要表达的条带了。
赞一下 回复此楼
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
3楼2012-05-26 22:22:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

damaomao

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw: 金币+1, 谢谢应助 2012-05-28 09:06:38
本帖内容被屏蔽
4楼2012-05-27 09:32:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ruoshui183

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 十分有帮助 2012-05-28 09:05:47
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2012-05-27 13:04:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ruoshui183 at 2012-05-27 13:04:44
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。
...

这个方法非常的棒！！
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-27 22:10:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦堂straw

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ruoshui183 at 2012-05-27 13:04:44
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。
...

谢谢。
打算按这种方法试一下，还想请教一下低浓度咪唑破碎液具体成分是什么？做蛋白表达没多久，每次都是直接用PBS洗了再加PBS溶解拿去破碎。还有留下的胶是直接用上样缓冲液混匀跑电泳吧？
再次感谢大虾相助！
赞一下 回复此楼
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
7楼2012-05-28 09:03:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

radium4046

铁虫 (初入文坛)
western blot检测一下就行了……
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-28 15:41:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 麦堂straw 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +7 Ncdx123456 2026-03-13 8/400 2026-03-16 12:15 by karry wen
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +6 一鸭鸭哟 2026-03-14 7/350 2026-03-15 22:12 by Winj1e
[考研] 材料工程专硕274一志愿211求调剂 +5 薛云鹏 2026-03-15 5/250 2026-03-15 20:38 by Logic2024
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +3 嘉年新程 2026-03-15 3/150 2026-03-15 13:58 by 哈哈哈哈嘿嘿嘿
[考研] 294求调剂 +3 Zys010410@ 2026-03-13 4/200 2026-03-15 10:59 by zhq0425
[考研] 材料工程327求调剂 +3 xiaohe12w 2026-03-11 3/150 2026-03-14 20:20 by ms629
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 【0703化学调剂】-一志愿华中师范大学-六级475 +5 Becho359 2026-03-11 5/250 2026-03-14 11:35 by 哦哦123
[考研] 301求调剂 +3 归零lbm 2026-03-09 3/150 2026-03-14 02:20 by JourneyLucky
[考研] 一志愿浙江大学0856材料与化工求调剂 +4 yansheng@211 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:10 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-12 7/350 2026-03-13 23:24 by 邱gl
[考研] 285 求调剂 资源与环境 一志愿北京化工大学 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:04 by JourneyLucky
[考研] 材料371求调剂 +9 鳄鱼? 2026-03-11 11/550 2026-03-13 22:53 by JourneyLucky
[考研] 0856材料与化工301求调剂 +5 奕束光 2026-03-13 5/250 2026-03-13 22:00 by 星空星月
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 314求调剂 +7 无懈可击的巨人 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:40 by JourneyLucky
[考研] 一志愿山大07化学 332分 四六级已过 本科山东双非 求调剂！ +3 不想理你 2026-03-12 3/150 2026-03-13 14:18 by JourneyLucky
[考研] 26考研求调剂 +5 丶宏Sir 2026-03-13 5/250 2026-03-13 13:05 by JourneyLucky
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +3 崔wj 2026-03-12 4/200 2026-03-12 19:33 by 求调剂zz
[考研] 数二英二309分请求调剂 +3 dtdxzxx 2026-03-09 4/200 2026-03-09 19:56 by yuningshan
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭