应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达中目的蛋白不明确
81/1返回列表
查看: 1648  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

麦堂straw

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达中目的蛋白不明确

初做蛋白表达，目的片段确定插入载体测序正确，用的BL21为宿主菌，尝试了各种条件，比如IPTG浓度有0.1mM、0.5mM、1mM，温度有37，30，25，蛋白电泳结果分析均无明显目的条带，虽在Marker相近位置处有条带表达，但未诱导前也有该条带的表达，且诱导后条带浓度的增加量并不是十分明显，所以很纠结到底是不是想要的目的条带。
请问各位大虾，碰到这种情况，要怎么办？我的蛋白带了His标签，如果我做镍柱纯化的话可否验证条带的正确性，我怕如果那条条带就算是目的条带的话，表达量太少我一纯化损失太多也看不到，求助我该如何处理？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
1楼 2012-05-25 22:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 辛苦哈 2012-05-26 10:54:49
麦堂straw: 金币+1, 谢谢应助 2012-05-28 09:06:19
首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-26 08:20:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦堂straw

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-26 08:20:48
首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。

谢谢回复。
已确认外源基因转入载体且测序正确，现在不确定的是外源基因有没有表达，因为条带不明显，像是又不像是目的条带，所以想通过纯化看一下，就是怕本来表达量少再一纯化就没了，也鉴别不了到底是不是要表达的条带了。
赞一下 回复此楼
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
3楼2012-05-26 22:22:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

damaomao

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw: 金币+1, 谢谢应助 2012-05-28 09:06:38
本帖内容被屏蔽
4楼2012-05-27 09:32:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ruoshui183

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 十分有帮助 2012-05-28 09:05:47
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2012-05-27 13:04:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ruoshui183 at 2012-05-27 13:04:44
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。
...

这个方法非常的棒！！
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-27 22:10:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

麦堂straw

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ruoshui183 at 2012-05-27 13:04:44
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。
...

谢谢。
打算按这种方法试一下，还想请教一下低浓度咪唑破碎液具体成分是什么？做蛋白表达没多久，每次都是直接用PBS洗了再加PBS溶解拿去破碎。还有留下的胶是直接用上样缓冲液混匀跑电泳吧？
再次感谢大虾相助！
赞一下 回复此楼
山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
7楼2012-05-28 09:03:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

radium4046

铁虫 (初入文坛)
western blot检测一下就行了……
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-28 15:41:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 麦堂straw 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +7 羊腰板 2026-08-21 7/350 2026-08-21 21:28 by iwuli
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 14/700 2026-08-21 16:51 by applepetty
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[基金申请] 人气不行了 +7 fansofjerry 2026-08-21 7/350 2026-08-21 14:13 by Vivilian
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +23 yaoyewhu2008 2026-08-20 25/1250 2026-08-21 12:19 by Poppy1104
[基金申请] 什么时候开奖？ +7 CrisMessi 2026-08-18 7/350 2026-08-21 12:15 by weiyin
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +15 archvillain 2026-08-15 27/1350 2026-08-21 11:32 by tim76
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +15 kkkl_v 2026-08-19 16/800 2026-08-21 11:22 by 365372687
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +4 archvillain 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:10 by gatelove
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭