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麦堂straw

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达中目的蛋白不明确

初做蛋白表达，目的片段确定插入载体测序正确，用的BL21为宿主菌，尝试了各种条件，比如IPTG浓度有0.1mM、0.5mM、1mM，温度有37，30，25，蛋白电泳结果分析均无明显目的条带，虽在Marker相近位置处有条带表达，但未诱导前也有该条带的表达，且诱导后条带浓度的增加量并不是十分明显，所以很纠结到底是不是想要的目的条带。
请问各位大虾，碰到这种情况，要怎么办？我的蛋白带了His标签，如果我做镍柱纯化的话可否验证条带的正确性，我怕如果那条条带就算是目的条带的话，表达量太少我一纯化损失太多也看不到，求助我该如何处理？
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山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
1楼 2012-05-25 22:43:19
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 专家考核, 辛苦哈 2012-05-26 10:54:49
麦堂straw: 金币+1, 谢谢应助 2012-05-28 09:06:19
首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。
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2楼2012-05-26 08:20:48
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麦堂straw

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-05-26 08:20:48
首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。

谢谢回复。
已确认外源基因转入载体且测序正确，现在不确定的是外源基因有没有表达，因为条带不明显，像是又不像是目的条带，所以想通过纯化看一下，就是怕本来表达量少再一纯化就没了，也鉴别不了到底是不是要表达的条带了。
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山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
3楼2012-05-26 22:22:02
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damaomao

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw: 金币+1, 谢谢应助 2012-05-28 09:06:38
本帖内容被屏蔽
4楼2012-05-27 09:32:23
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ruoshui183

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
麦堂straw: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 十分有帮助 2012-05-28 09:05:47
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2012-05-27 13:04:44
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ruoshui183 at 2012-05-27 13:04:44
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。
...

这个方法非常的棒！！
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6楼2012-05-27 22:10:29
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麦堂straw

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ruoshui183 at 2012-05-27 13:04:44
推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。
...

谢谢。
打算按这种方法试一下，还想请教一下低浓度咪唑破碎液具体成分是什么？做蛋白表达没多久，每次都是直接用PBS洗了再加PBS溶解拿去破碎。还有留下的胶是直接用上样缓冲液混匀跑电泳吧？
再次感谢大虾相助！
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山有木兮木有枝，心悦君兮君不知。
7楼2012-05-28 09:03:52
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radium4046

铁虫 (初入文坛)
western blot检测一下就行了……
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8楼2012-05-28 15:41:30
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