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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】原核表达 蛋白没有表达求助！
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】原核表达 蛋白没有表达求助！ 已有12人参与

构建了3个融合基因片段，倒入PQE30载体，测序正确后，诱导表达只有1个蛋白表达了，条件都是一样的
转化，摇菌12H，菌液PCR验证正确，转接， 37℃2.5H ，1:50转接 37℃，1MMOL/L IPTG 1：1000 诱导3H，超声裂菌，SDS-PAGE结果其中的一个表达了，2个没有表达，求助，谢谢！
有位虫友告诉我 让我重新连接，转化，可是我测序是正确的啊！ 不知道是什么原因?

[ Last edited by jiangkuo0520 on 2010-6-29 at 21:42 ]
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1楼 2010-06-28 09:19:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

liyong1981

金虫 (正式写手)
原核表达有时候看运气~
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5楼2010-06-28 09:37:26
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普通回帖

tigerpaw

木虫 (正式写手)
有没有跑琼脂糖凝胶验证一下转进去了没有？
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聪明的人能洞察事物未来的发展趋势，他们在洪水来之前养鸭而不养鸡。
2楼2010-06-28 09:23:22
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by tigerpaw at 2010-06-28 09:23:22:
有没有跑琼脂糖凝胶验证一下转进去了没有？

做了菌液PCR，有目的条带
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3楼2010-06-28 09:31:13
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客
★
看天(金币+1):鼓励回答 2010-06-28 09:33:52
pcr假阳性太多了
不过不表达也是常事
还有表达了，表达量不大也是常事
或者是蛋白对菌活性有毒性，不表达也正常
恩，还有载体的突变问题……
太多了，具体问题要具体分析……
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For my life！
4楼2010-06-28 09:32:50
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by winter_gates at 2010-06-28 09:32:50:
pcr假阳性太多了
不过不表达也是常事
还有表达了，表达量不大也是常事
或者是蛋白对菌活性有毒性，不表达也正常
恩，还有载体的突变问题……
太多了，具体问题要具体分析……

请问，我现在应该怎么办啊？
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6楼2010-06-28 09:38:27
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jiangkuo0520

金虫 (正式写手)
有人有这方面的经验吗？
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7楼2010-06-28 10:16:17
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liyong1981

金虫 (正式写手)
都说了看运气的~
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8楼2010-06-28 10:35:59
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yx_sun70

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-28 10:42:10
jiangkuo0520(金币+1):据师姐经验此蛋白应该以包涵体表达 2010-06-28 12:00:01
看你表达的蛋白是何种类型蛋白，一般情况下水溶蛋白好表达，如谷胱甘肽S转移酶，若是真核生物膜蛋白、或是蛋白中有信号台等则不宜表达，还有有时表达的量太低，sds-page检测不到，只能werstern杂交才能检测。所以先要好好分析一下基因的种类特点。
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9楼2010-06-28 10:40:20
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liyong1981

金虫 (正式写手)
楼上正解·
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10楼2010-06-28 10:42:03
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