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swallow2007

木虫 (初入文坛)

[交流] 【求助】 关于原核表达【有效日期截止：2011年2月28日】

我诱导表达了一个38KD左右的可溶性蛋白，使用pCold1-4作为表达载体，以BL21(DE3)作为宿主。现存在以下问题，敬请各位大侠帮助！
1.按照说明书，我在OD600=0.6-0.8时加入IPTG，15℃诱导过夜。诱导条件已经过优化，IPTG浓度1mM，15℃诱导24小时为最佳。以空载体作为对照，诱导过夜后，SDS-PAGE电泳后，无目的蛋白出现，并且和对照没有什么区别。但是拿得到的蛋白做活性分析的时候发现有活性，Why?
2.目的蛋白的等电点为7.34，所用的buffer是Tris-HCl (pH 7.5) ,是否会造成在E.Coli细胞破碎过程中目的蛋白的沉淀？
3.若是用带有His-tag的pCold2，纯化采用的是His TALON Gravity Columns Purification Kit，该试剂盒中的所有buffer的pH都是7.34。问题是蛋白不挂柱，在上样之后立马掉下来，是否和buffer的pH值有关？
4.若是组氨酸标签被包裹在蛋白质内部，该如何纯化，在哪步加入8M的尿素？

[ Last edited by swallow2007 on 2011-2-8 at 12:41 ]
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1楼 2011-02-08 12:36:43
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wjwang123

木虫 (知名作家)
★
swallow2007(金币+1):谢谢参与
swallow2007(金币+1): 2011-02-09 08:42:27
不懂啊，顶一下！
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3楼2011-02-08 16:37:20
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AZURESKY1999

至尊木虫 (知名作家)
★
swallow2007(金币+1):谢谢参与
swallow2007(金币+44): 谢谢啊，我也想到了这一点儿，将缓冲液的pH调整到8.0，依然和对照没什么区别，下一步打算用8M的尿素，谢谢你！ 2011-02-09 08:45:09
如果楼主表达的是可溶性蛋白，一般而言，所需要的目的蛋白在溶液中，由于目的蛋白的等电点在7.34左右，建议所用的缓冲液的PH值要远离该等电点，即用PH7.5的缓冲液不好，可以考虑PH6.5左右或8.0以上，不然目的蛋白在PH7.5时容易沉淀，会导致目的蛋白沉淀从而损失较多的目的蛋白，对以后的纯化造成困难，如果用亲和层析纯化，一开始也可以用8M尿素溶解蛋白的，也可以考虑其它纯化方式，如离子交换，疏水层析等
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4楼2011-02-08 16:43:25
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魔男小崔

铁杆木虫 (著名写手)
★
swallow2007(金币+1):谢谢参与
我生物、化学都扔了许多年了
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5楼2011-02-08 22:51:58
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nnsulei

金虫 (正式写手)
我也遇到类似情况
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6楼2011-03-31 10:41:42
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nnsulei

金虫 (正式写手)
换载体行吗
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7楼2011-03-31 10:42:01
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肥宝

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
需要诱导24小时那么久？我们最多过夜16小时。大剂量看不出表达的话，有可能是表达量少，可以破了细胞挂柱子富集一下再看。bufferPH和PI最好相差1，否则破碎时蛋白容易沉淀。8M尿素沉淀对后期的蛋白活性有影响，如果对活性要求不是特别高的话可以用。也可以试试硫酸铵沉淀，离子交换，疏水，先富集些确认有没有你的目的蛋白。有条件的话，破碎后的上清打LCMS，确认有目的蛋白。祝你好运。
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8楼2012-01-04 10:31:47
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简单回复
xyfei2楼
2011-02-08 15:12   回复  
swallow2007(金币+1):谢谢参与
swallow2007(金币+1, 博学EPI+1): 2011-02-09 08:42:20
YUE-jf(博学EPI-1): 无效 2011-04-06 11:36:38
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