| 查看: 2122 | 回复: 7 | |||
[交流]
【求助】 关于原核表达【有效日期截止：2011年2月28日】
|
|||
|
我诱导表达了一个38KD左右的可溶性蛋白，使用pCold1-4作为表达载体，以BL21(DE3)作为宿主。现存在以下问题，敬请各位大侠帮助！ 1.按照说明书，我在OD600=0.6-0.8时加入IPTG，15℃诱导过夜。诱导条件已经过优化，IPTG浓度1mM，15℃诱导24小时为最佳。以空载体作为对照，诱导过夜后，SDS-PAGE电泳后，无目的蛋白出现，并且和对照没有什么区别。但是拿得到的蛋白做活性分析的时候发现有活性，Why? 2.目的蛋白的等电点为7.34，所用的buffer是Tris-HCl (pH 7.5) ,是否会造成在E.Coli细胞破碎过程中目的蛋白的沉淀？ 3.若是用带有His-tag的pCold2，纯化采用的是His TALON Gravity Columns Purification Kit，该试剂盒中的所有buffer的pH都是7.34。问题是蛋白不挂柱，在上样之后立马掉下来，是否和buffer的pH值有关？ 4.若是组氨酸标签被包裹在蛋白质内部，该如何纯化，在哪步加入8M的尿素？ [ Last edited by swallow2007 on 2011-2-8 at 12:41 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
大佬帮着分析今年的评审意见？该课题连续申请了三年了，明年要不要换个方向。
已经有11人回复
-
两块石头
已经有10人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有6人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有6人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有6人回复
-
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有6人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有8人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有6人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
【征稿中！】2026年机械、制造技术与材料国际会议 (MEMTM 2026)
+1/331
-
招收大湾区大学-哈工深联培博士1名
+1/194
-
武汉，诚征男友，如果合适，异地也可以
+1/94
-
仪器行业公众号-仪器王
+1/93
-
瑞算科技——电化学模拟服务（第一性原理计算、分子动力学、机器学习）
+1/91
-
大湾区大学和中山大学联合培养物理方向（理论计算）博士生，27年秋季入学
+1/87
-
国际普刊投稿（不需要版面费）
+1/86
-
2027级博士研究生——质谱分析
+5/60
-
来看看还有认识的人吗
+1/48
-
评职称需要，卖发明专利了:D有技术储备需求的设备厂商可联系
+1/18
-
某知名美资公司招应用工程师（AS， 北京）
+1/10
-
吉林大学高压与超硬材料全国重点实验室李达教授课题组招收2027申请考核制博士
+1/7
-
合肥工业大学许婷婷老师招收2027年入学博士研究生，有机/高分子合成背景
+1/5
-
天津大学浙江研究院2026年第二批招聘公告：高分子等方向特聘青年研究员/博士后
+1/3
-
Paris Saclay university, Dallerac教授团队招收2027CSC–Saclay合作奖学金博士生
+1/3
-
新加坡国立大学Sibudjing Kawi教授课题组part-time PhD（热催化/等离子体催化方向）
+1/2
-
天津大学浙江研究院2026年第二批招聘公告：高分子等方向特聘青年研究员/博士后
+1/2
-
AI for Biology / 生物信息 / 空间转录组方向硕士，诚寻博士导师及课题组
+1/1
-
给CCR期刊投稿要交proposal吗
+1/1
-
电子科技大学医学院/四川省人民医院 国家级青年人才课题组诚聘博士后
+1/1
3楼2011-02-08 16:37:20
★
swallow2007(金币+1):谢谢参与
swallow2007(金币+44): 谢谢啊，我也想到了这一点儿，将缓冲液的pH调整到8.0，依然和对照没什么区别，下一步打算用8M的尿素，谢谢你！ 2011-02-09 08:45:09
swallow2007(金币+1):谢谢参与
swallow2007(金币+44): 谢谢啊，我也想到了这一点儿，将缓冲液的pH调整到8.0，依然和对照没什么区别，下一步打算用8M的尿素，谢谢你！ 2011-02-09 08:45:09
| 如果楼主表达的是可溶性蛋白，一般而言，所需要的目的蛋白在溶液中，由于目的蛋白的等电点在7.34左右，建议所用的缓冲液的PH值要远离该等电点，即用PH7.5的缓冲液不好，可以考虑PH6.5左右或8.0以上，不然目的蛋白在PH7.5时容易沉淀，会导致目的蛋白沉淀从而损失较多的目的蛋白，对以后的纯化造成困难，如果用亲和层析纯化，一开始也可以用8M尿素溶解蛋白的，也可以考虑其它纯化方式，如离子交换，疏水层析等 |
4楼2011-02-08 16:43:25
5楼2011-02-08 22:51:58
6楼2011-03-31 10:41:42
7楼2011-03-31 10:42:01
8楼2012-01-04 10:31:47
简单回复
xyfei2楼
2011-02-08 15:12
回复
swallow2007(金币+1):谢谢参与
swallow2007(金币+1, 博学EPI+1): 2011-02-09 08:42:20
YUE-jf(博学EPI-1): 无效 2011-04-06 11:36:38
swallow2007(金币+1, 博学EPI+1): 2011-02-09 08:42:20
YUE-jf(博学EPI-1): 无效 2011-04-06 11:36:38
