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辉辉集团

银虫 (正式写手)

[交流] 原核表达蛋白降解 有效期到2010.8.5

我在做原核表达时，加了组氨酸标签，然后用镍柱纯化，纯化出来的蛋白跑电泳条带很好，纯度很高，但是用PBS透析掉咪唑，再用聚乙二醇浓缩后，然后再去跑电泳，条带变杂了很多，我怀疑是蛋白降解了，请问各位高手 怎么办  谢谢！
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1楼 2010-07-19 17:07:08
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辉辉集团

银虫 (正式写手)
什么情况
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2楼2010-07-20 08:24:45
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天煞孤星A
xjxlovelxl:http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=1644147&fpage=1请仔细阅读，欢迎常来有奖版答疑 2010-07-20 12:58:06
3楼2010-07-20 09:14:55
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entomology557

铁杆木虫 (知名作家)
已经纯化出来了为什么还要去咪唑啊
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生物进化基本常识：一定范围内，选择压力越大，要么进化的越快来适应这种压力，或者直接被淘汰。
4楼2010-07-20 13:19:12
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sunrise907

至尊木虫 (著名写手)

至尊木虫
信息不够详细啊，能够给出两次电泳图就好了。

这不一定是降解吧，镍柱纯化多少会有一些杂蛋白的，可能在你洗脱液中的浓度比较低，跑胶看不出来，浓缩后浓度变高才看出来了。

可以在纯化的时候加入蛋白酶抑制剂吧，如果还是这样可能就是杂蛋白所致，不放心的话送胶或分子筛分离后样品测个质谱看看吧
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我就是我，是颜色不一样的烟火，天空海阔，要做最坚强的泡沫。
5楼2010-07-20 14:13:16
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andyduan

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2010-07-20 14:40:00
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辉辉集团

银虫 (正式写手)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by andyduan at 2010-07-20 14:40:00:
你要参考对比目的条带前后的亮度和杂带的对比差别，才可以确定是 不是降解了，也可能是浓缩造成的杂带白富集所以杂蛋白条带比之前亮了

嗯 这个我有考虑过的 但是我采用的浓度是相当的呀 谢谢
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7楼2010-07-22 11:41:00
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辉辉集团

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by sunrise907 at 2010-07-20 14:13:16:
信息不够详细啊，能够给出两次电泳图就好了。

这不一定是降解吧，镍柱纯化多少会有一些杂蛋白的，可能在你洗脱液中的浓度比较低，跑胶看不出来，浓缩后浓度变高才看出来了。

可以在纯化的时候加入蛋白酶抑制 ...

我知道肯定会有一定的杂蛋白
但是不可能会这么多啊 我浓度是差不多的呀
而且我还尝试了过了镍柱 再过分子筛的 还是一样啊 会出现那些杂条带
赞一下 回复此楼
8楼2010-07-22 11:42:49
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sunrise907

至尊木虫 (著名写手)

至尊木虫
辉辉集团(金币+10, 博学EPI+1):先谢谢你了 2010-07-23 08:43:23
引用回帖:
Originally posted by 辉辉集团 at 2010-07-22 11:42:49:

我知道肯定会有一定的杂蛋白
但是不可能会这么多啊 我浓度是差不多的呀
而且我还尝试了过了镍柱 再过分子筛的 还是一样啊 会出现那些杂条带

浓缩后的样品在跑胶前稀释了？两次蛋白总量一致的话可能降解了

杂带的位置怎样，分子量大小如何？小的杂带可能是降解了

直接镍柱纯化的样品和浓缩后的样品跑分子筛结果一致？不是的话可能降解了

分子筛的分离样品直接跑胶的吗？直接跑胶和放置一段时间结果不一致可能是降解了

你给的信息还是太少，很难判断的。。

怀疑是降解的话测质谱比对就可以确定了

严格的说蛋白纯化时是应该加蛋白酶抑制剂的，你可以试试

以上，希望有帮助
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我就是我，是颜色不一样的烟火，天空海阔，要做最坚强的泡沫。
9楼2010-07-22 17:59:48
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辉辉集团

银虫 (正式写手)

谢谢

引用回帖:
Originally posted by sunrise907 at 2010-07-22 17:59:48:



浓缩后的样品在跑胶前稀释了？两次蛋白总量一致的话可能降解了

杂带的位置怎样，分子量大小如何？小的杂带可能是降解了

直接镍柱纯化的样品和浓缩后的样品跑分子筛结果一致？不是的话可能降解了

分 ...

嗯 应该是降解了 非常感谢 呵呵
可以告诉我你的QQ不，跟你学习下  呵呵
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10楼2010-07-23 08:40:08
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