原核表达 PET-30载体目的蛋白分子量偏小？ - 分子生物 - 综合其他

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lxj341401

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1949stone(金币+3): 鼓励 2012-03-02 21:27:46

目的蛋白要比预测的小4kD左右（目的条带约55kD）如果SDS-PAGE结果的话也不能说明真的小，SDS-PAGE出来的只是表观分子量，不是真实分子量。如果不符，可以利用质谱、凝胶排阻等确认。

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2楼2012-03-01 19:47:37

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zzjzheng

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3楼2012-03-01 20:52:57

lxj341401

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1949stone(金币+1): 鼓励讨论 2012-03-02 21:28:07
zzjzheng(金币+2): 2012-03-03 16:06:23

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3楼: Originally posted by zzjzheng at 2012-03-01 20:52:57:
这个质谱是不是跟分析化合物质谱差不多啊？凝胶排阻需要哪些东西啊？我们这条件有限，以前师兄师姐都不怎么做分子，所以对这方面了解较少……

有点不一样，是飞行质谱。
质谱和凝胶排阻都要蛋白纯化后做，凝胶排阻就是凝胶过滤，需要一些已知分子量的蛋白做为标准。

4楼2012-03-01 21:07:43

gaohuijy

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楼主的那个预测蛋白分子量是怎么预测啊

5楼2012-03-02 21:24:05

zzjzheng

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6楼2012-03-03 12:16:43

zzjzheng

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7楼2012-03-03 12:19:24

lxj341401

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7楼: Originally posted by zzjzheng at 2012-03-03 12:19:24:
这位仁兄，你看电泳跑出的结果跟网上预测结果相差4kD~5kD,这属于正常范围吗？？？

正常，但最好别的方法验证下。

8楼2012-03-03 13:51:47

zzjzheng

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9楼2012-03-03 16:05:13

zhouzejun202

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诱导表达后马上跑电泳。

10楼2012-03-03 16:30:10

zzjzheng

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11楼2012-03-03 18:11:19

zzjzheng

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12楼2012-03-03 19:59:25

lxj341401

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12楼: Originally posted by zzjzheng at 2012-03-03 19:59:25:
兄台，你看我这个分析的对不对，我的上样缓冲液里没有加β-巯基乙醇，但是目的蛋白氨基酸序列里含有半胱氨酸，是不是会形成二硫键使目的蛋白没有完全打开，最终导致跑出来的条带偏小？？？

如果是分子间形成二硫键，形成二聚体或多聚体，分子量会偏大；如果是分子内形成二硫键，分子量不变。

13楼2012-03-03 20:27:57

a731705125

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13楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-03-03 20:27:57:
如果是分子间形成二硫键，形成二聚体或多聚体，分子量会偏大；如果是分子内形成二硫键，分子量不变。

学习了，不过分子形状对分子量大小也有影响吧，分子内形成二硫键应该体积变小，是不是分子量要相对小些？

14楼2012-03-03 20:58:46

lxj341401

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14楼: Originally posted by a731705125 at 2012-03-03 20:58:46:
学习了，不过分子形状对分子量大小也有影响吧，分子内形成二硫键应该体积变小，是不是分子量要相对小些？

对，所以最好验证下。

15楼2012-03-03 23:05:46

Jathan

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看虫友们回帖，长了不少知识啊～

16楼2013-03-27 16:48:49

chenxiang29

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我最近也出现了这种问题，请问楼主现在找到原因了么

17楼2013-05-06 21:52:55

lihuahan

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你好，正在做原核表达，想请问一下表达载体应该怎么选择尼？后期是要用纯化目的蛋白做抗体的，pET-22，pET-28，pET-30，我应该怎么选择尼？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

18楼2014-04-30 19:43:27

zbblpp

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最近做表达，也出现了这个问题。蛋白一部分上清表达，一部分包涵体，上清为20KD，包涵体尿素溶解后只有14.用的PET28A载体，测序没有问题，实在不知道什么原因了

19楼2014-08-01 23:20:43