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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白激酶原核表达
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guojj

铁虫 (初入文坛)

[交流] 蛋白激酶原核表达 已有5人参与

大家好：
    我先要原核表达纯化一中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 我们实验室做的是细菌，一般用PET-28a或32a表达载体，转入BL21中，上Ni柱亲和纯化重组蛋白。开始原核表达前会分析该蛋白的信号肽、跨膜区，一般去除跨膜区再原核表达的。我的问题是：
     1、我要表达的这个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶由660个氨基酸组成，跨膜区在中间，即蛋白一部分在膜内，一半在膜外。若去除跨膜区，蛋白活性会不会有影响？因为该蛋白是一种激酶。
    2、若全长表达，编码基因过长我。现在是全长克隆，刚连上PMD18-T载体，转化后挑阳性克隆测序，测序序列与我们目的基因序列不能100%吻合，已测过6次序列，均不能100%成功。怎么办呢？
    3、表达载体要不要换呢？
    欢迎各位提出宝贵意见，谢谢。
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1楼 2012-05-18 10:34:47
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dshlove

木虫 (正式写手)
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silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 第二个需要高保真酶pfu，taq是不行的 2012-05-22 12:58:32
因为我最近在做肠激酶，所以给你说说我的想法。
第一个问题：你首先要确定你的蛋白，去NCBI或者uniport，找出相对应的序列，上面有活性位点的区域标识，你把你的跨膜区表达蛋白序列区间去比对，看是不是在活性区间内。才能确定是否影响。
第二个问题，说明你的insert有问题，要不就是在准备提质粒过程中生长突变了，不过可能性不大。还有最大可能就是你PCR目的基因片段时候的Taq酶有问题，建议你试试takara master mix试试，我们最近也换这种的，效果很好，P的也快。
第三个问题，如果你的载体能连接上目的基因就是没问题的，那就不要换了，省的还要重新设计引物，还要P载体。
好像就这么多了。希望能帮上你。
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7楼2012-05-22 09:08:13
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guojj

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 丫头7976 at 2012-05-20 08:43:17:
660也不算大，那你就重新PCR然后连T载体，你的pcr酶要用高保真的，否则就很容易出现碱基突变的

谢谢回复。请推荐一种高保真的pcr酶。我们一直用TaRaKa的ExTaq酶，但对于2000bp好像有突变啊。
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3楼2012-05-20 13:24:31
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丫头7976

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
660也不算大，那你就重新PCR然后连T载体，你的pcr酶要用高保真的，否则就很容易出现碱基突变的
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2楼2012-05-20 08:43:17
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议你多查查外文文献，肯定有关于蛋白激酶原核表达的文章，你的目的基因并不大，如果测序出现突变，你可以1. 更换PCR酶，使用高保真的酶，如果连接T载体，回收后再进行加A反应，2. 设计纠正引物。
我们做3000bp的基因一般都是一次成功，很少出现突变的，用的酶是takara的pyrobest DNA polymerase
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guojj
Never say never
4楼2012-05-21 09:17:30
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guojj

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by shenlin0514 at 2012-05-21 09:17:30:
建议你多查查外文文献，肯定有关于蛋白激酶原核表达的文章，你的目的基因并不大，如果测序出现突变，你可以1. 更换PCR酶，使用高保真的酶，如果连接T载体，回收后再进行加A反应，2. 设计纠正引物。
我们做3000bp的

谢谢啦，我再查查文献。
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5楼2012-05-21 12:44:47
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guojj

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shenlin0514 at 2012-05-21 09:17:30:
建议你多查查外文文献，肯定有关于蛋白激酶原核表达的文章，你的目的基因并不大，如果测序出现突变，你可以1. 更换PCR酶，使用高保真的酶，如果连接T载体，回收后再进行加A反应，2. 设计纠正引物。
我们做3000bp的

你好，shenlin0514.我查了takara的pyrobest DNA polymerase使用说明书，PCR后是平滑末端，如果连接T载体，回收后再进行加A反应，与pMD18-T相连，做原核克隆表达。
请问“加A反应”你们一般是怎样做的？
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6楼2012-05-22 08:34:24
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by guojj at 2012-05-22 08:34:24:
你好，shenlin0514.我查了takara的pyrobest DNA polymerase使用说明书，PCR后是平滑末端，如果连接T载体，回收后再进行加A反应，与pMD18-T相连，做原核克隆表达。
请问“加A反应”你们一般是怎样做的？

把你的目的片段回收后（可以用45μl ddH2O或TE洗脱），加入4μl的dNTP或dATP，含有5μl 10*PCR buffer，和0.5μl的Taq DNA polymerase，混合后置于PCR仪中进行72℃延伸10-20分钟，然后直接回收就可以了。
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Never say never
8楼2012-05-22 10:05:49
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guojj

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by dshlove at 2012-05-22 09:08:13:
因为我最近在做肠激酶，所以给你说说我的想法。
第一个问题：你首先要确定你的蛋白，去NCBI或者uniport，找出相对应的序列，上面有活性位点的区域标识，你把你的跨膜区表达蛋白序列区间去比对，看是不是在活性区间

谢谢回复，我刚定了T啊TaKaRa的Prime STAR DNA聚合酶，不知效果如何。
引物我决定重新设计的，但是你说的“找出相对应的序列，上面有活性位点的区域标识，你把你的跨膜区表达蛋白序列区间去比对，看是不是在活性区间内。”这部分不是特别懂，你能说的再细一些吗？“活性区间”怎么找？
谢谢啊
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9楼2012-05-22 10:26:39
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
NEB Phusion Taq
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10楼2012-05-22 12:25:27
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