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蛋白激酶原核表达已有5人参与
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大家好： 我先要原核表达纯化一中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 我们实验室做的是细菌，一般用PET-28a或32a表达载体，转入BL21中，上Ni柱亲和纯化重组蛋白。开始原核表达前会分析该蛋白的信号肽、跨膜区，一般去除跨膜区再原核表达的。我的问题是： 1、我要表达的这个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶由660个氨基酸组成，跨膜区在中间，即蛋白一部分在膜内，一半在膜外。若去除跨膜区，蛋白活性会不会有影响？因为该蛋白是一种激酶。 2、若全长表达，编码基因过长我。现在是全长克隆，刚连上PMD18-T载体，转化后挑阳性克隆测序，测序序列与我们目的基因序列不能100%吻合，已测过6次序列，均不能100%成功。怎么办呢？ 3、表达载体要不要换呢？ 欢迎各位提出宝贵意见，谢谢。 |
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dshlove
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 第二个需要高保真酶pfu，taq是不行的 2012-05-22 12:58:32
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+6, BioEPI+1, 应助指数+1, 第二个需要高保真酶pfu，taq是不行的 2012-05-22 12:58:32
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因为我最近在做肠激酶，所以给你说说我的想法。 第一个问题：你首先要确定你的蛋白，去NCBI或者uniport，找出相对应的序列，上面有活性位点的区域标识，你把你的跨膜区表达蛋白序列区间去比对，看是不是在活性区间内。才能确定是否影响。 第二个问题，说明你的insert有问题，要不就是在准备提质粒过程中生长突变了，不过可能性不大。还有最大可能就是你PCR目的基因片段时候的Taq酶有问题，建议你试试takara master mix试试，我们最近也换这种的，效果很好，P的也快。 第三个问题，如果你的载体能连接上目的基因就是没问题的，那就不要换了，省的还要重新设计引物，还要P载体。 好像就这么多了。希望能帮上你。 |
7楼2012-05-22 09:08:13
2楼2012-05-20 08:43:17
3楼2012-05-20 13:24:31
shenlin0514
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guojj
4楼2012-05-21 09:17:30