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蛋白激酶原核表达已有5人参与
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大家好： 我先要原核表达纯化一中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 我们实验室做的是细菌，一般用PET-28a或32a表达载体，转入BL21中，上Ni柱亲和纯化重组蛋白。开始原核表达前会分析该蛋白的信号肽、跨膜区，一般去除跨膜区再原核表达的。我的问题是： 1、我要表达的这个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶由660个氨基酸组成，跨膜区在中间，即蛋白一部分在膜内，一半在膜外。若去除跨膜区，蛋白活性会不会有影响？因为该蛋白是一种激酶。 2、若全长表达，编码基因过长我。现在是全长克隆，刚连上PMD18-T载体，转化后挑阳性克隆测序，测序序列与我们目的基因序列不能100%吻合，已测过6次序列，均不能100%成功。怎么办呢？ 3、表达载体要不要换呢？ 欢迎各位提出宝贵意见，谢谢。 |
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