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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的蛋白加myc或his标签？
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

[求助] 目的蛋白加myc或his标签？

最近在研究一个蛋白的表达量，但是来不及做抗体了，想直接在目的蛋白的后面l连个myc或his标签，可以直接用标签的抗体来检测目的蛋白的变化。
但是我的目的基因（蓝藻、原核生物）与它前后的基因均存在重叠的部分，如果加标签会不会影响它前后基因的功能？这种情况还能加标签吗？怎么加？
请高手指点！我是个新虫，金币较少，请见谅！
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1楼2011-07-25 19:05:39
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ybs007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-25 20:42:46
shuihaizi(金币+2): 2011-07-25 21:58:36
楼主说的目的基因与它前后的基因均存在重叠是什么意思？不太明白。
以我个人的经验，可以在你目的蛋白加上标签，在标签和目的蛋白之间引入一个蛋白酶，这样你可以通过标签抗体来定表达量，然后用蛋白酶切割来研究目的蛋白。这样不仅可以定量，也可以研究蛋白性质。 具体可以再N端加上His标签，His标签与目的蛋白之前引入肠激酶。PS：比较推荐使用肠激酶的原因是肠激酶识别序列是DDDDK而发生切割是在K的后面，也就是说可以让你的目的蛋白有完整的N端，但是如果你目的蛋白序列里存在DDDDK或者DDDK或者DDK甚至DK都会发生非特异切割。如果这种情况就不建议您使用了。
貌似跑题了。。。。总之，有问题再交流 = =！
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平生我自知
2楼2011-07-25 20:27:38
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shuihaizi

金虫 (小有名气)
我的目的基因是原核生物，目前试验不需要切掉标签(原核生物能表达肠激酶吗？)，我只想在目的基因上连个Myc，从而用Myc的抗体进行检测.关键问题是：在基因组中，目的基因的前后基因的编码区有重叠，比如说ABC三个基因，其中A的末尾是B的开始，而B的末尾又是C的开始，不知道这样你明白吗？我担心在目的基因B末尾(即TAA之前）连上标签，会影响C的不知道结构和功能。不知道你是否有遇到过相关的问题？
谢谢你的回答，很受益。
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3楼2011-07-25 22:05:35
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cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-07-25 23:46:08
shuihaizi(金币+3): 2011-07-26 08:34:07
有可能会受影响。可不可以考虑把tag加在最末一个阅读框的终止密码之前呢
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净——静——竞——进
4楼2011-07-25 22:44:53
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ybs007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good! 2011-07-25 23:47:59
shuihaizi(金币+5): 2011-07-26 08:34:25
引用回帖:
Originally posted by shuihaizi at 2011-07-25 22:05:35:
我的目的基因是原核生物，目前试验不需要切掉标签(原核生物能表达肠激酶吗？)，我只想在目的基因上连个Myc，从而用Myc的抗体进行检测.关键问题是：在基因组中，目的基因的前后基因的编码区有重叠，比如说ABC三个基 ...

这个问题确实挺麻烦，不知道你所说的A和C基因承担的是调控作用呢 还是跟B一样表达出蛋白。如果是前者，引入标签多半会影响功能，我有一个想法，比如把tag加到AB之间，在tag的前端重构A和B的重叠区，在tag后也重建这个重叠区，相当于把这两个基因分开，这样不知道是否可行。如果是后者你是不是可以像楼上说的那样避开重叠区域加到整个蛋白的前端或者末端呢。
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平生我自知
5楼2011-07-25 23:42:28
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shuihaizi

金虫 (小有名气)
谢谢两位的回答。
cloverplm
不知道三个基因是否共转录，而且三个基因都是未知功能。所以要知道B的表达变化，把标签连到C上，把我不是很大。
ybs007
你说的办法我也想过，如果找不到更好的方法，我就试试看！

谢谢你们的回答，我还不怎么会用论坛，不知道怎样直接回复，所以先写了你们的名字，十分感谢！
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6楼2011-07-26 08:39:56
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dasheng1980

铁杆木虫 (知名作家)

大圣
学习了，非常感谢分享。
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dasheng1980
7楼2011-12-11 10:59:35
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辉辉集团

银虫 (正式写手)
不错 学习下
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8楼2011-12-11 13:58:47
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lyl19860712

金虫 (小有名气)
不错，受教了
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9楼2012-06-20 10:14:46
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lyl19860712

金虫 (小有名气)
引用回帖:
702088楼: Originally posted by ybs007 at 2011-07-25 23:42:28
这个问题确实挺麻烦，不知道你所说的A和C基因承担的是调控作用呢 还是跟B一样表达出蛋白。如果是前者，引入标签多半会影响功能，我有一个想法，比如把tag加到AB之间，在tag的前端重构A和B的重叠区，在tag后也重建这 ...

有一点比较疑惑，还想请各位大虾指教。可不可以把Tag放在A基因的启动子后面呢，但需要注意不要发生移码突变，我也是新手，不知道我的想法是否正确？
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10楼2012-06-20 10:25:37
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