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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达形成了包涵体怎么办啊？
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本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看

ningxi123456

金虫 (小有名气)

[求助] 原核表达形成了包涵体怎么办啊？

我的目的基因是水稻中克隆出来的，连到PET24上做原核表达，表达出来了，大小也对，但是在纯化跑SDS-PAGE电泳后发现它在沉淀里面，形成了包涵体。该怎么办啊？原核表达我都做了半年了，现在形成了包涵体，更是郁闷，各位大侠，谁能帮我解决下啊，感激不尽~！！！
      我的目的蛋白大概38Da，按1:100加入500ml的LB培养基中摇菌至OD600=0.6，加入0.7mM的IPTG，37°C诱导三个小时。
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1楼 2012-03-26 15:53:54
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回帖置顶 ( 共有2个 )

imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ningxi123456: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-03-26 19:04:56
amisking: 回帖置顶 2012-03-26 19:55:20
amisking: MolEPI+1, 鼓励新虫发帖交流！ 2012-03-26 19:55:26
我也遇到过这种情况，的确很难解决，我觉得可以从以下几点尝试：
1.降低温度，最容易想到的方法，文献中有很多都是这么做的，但是有时候效果并不是很明显，最多可降至8℃；
2.分析自己序列的疏水氨基酸含量，并进行信号肽预测，必要时可将信号肽切除，因为一般来说信号肽中疏水氨基酸多，会影响蛋白质可溶；
3.可以做一个OD值的梯度，OD0.4-0.6是分子克隆提供的条件，很多文献也这么做，但是这个条件不适合溶解性低的蛋白，OD1.0时效果一般比较好，你可以试试别的OD值。
4.IPTG的浓度影响不太大，但是我试过将IPTG浓度降低十倍，一点儿也不影响效果，IPTG价格还是比较贵的，能省就省吧。
5.如果上述都不行，就只剩最后一种方法了，换载体，对于研究生来说周期应该也不长，毕竟都做过这个，例如PET-30a之类的。
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
3楼2012-03-26 17:43:29
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 恩，很热心哦 2012-03-27 11:17:18
事实上，大部分外源蛋白在大肠杆菌中表达时都是形成包涵体（除非一些较小的，二硫键较少（1对）的）。
解决办法一般有三个：
1： 与一些助溶的蛋白融合表达：如：常用的GST，TrxA融合表达载体等
2：共表达一些伴侣类分子，如Dsb系列，等有大量文献报道，但不如1的效果好。
3.改变表达条件：如上所述，包括降低诱导强度（IPTG=0.1mM),降低诱导温度（12-16度）等，然后从裂菌上清中纯化可溶的部分，有时候，也能得到足够的可溶蛋白（如果你加了Histag方便纯化）
听起来，你们实验室的分子生物学不是强项，否则，可以很快将集中最常用的融合表达都试一遍。如果3还不行，则直接考虑做变性复性吧，还是可以得到一点可溶蛋白的
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5楼2012-03-26 21:26:48
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

姑娘

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+5, 鼓励新虫积极应助交流哈 2012-04-06 10:07:45
ningxi123456: 金币+2 2012-04-10 15:38:43
ningxi123456: 金币+2 2012-04-25 20:31:14
在原核细胞中的表达，要受原核细胞基因表达的多级调控影响，如基因结构的调控。利用宿主菌的调控系统调节外源基因的表达，防止外源基因的表的产物对宿主菌毒害如包涵体。那既然是这样的原因，是不是可以做点什么让包涵体进行裂解呢？？然后包涵体裂解物经过透析复性后,应该可获得较高纯度的复性目的蛋白。至于如何裂解包涵体，应该去找一些文献，看看！
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6楼2012-04-06 10:02:08
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yanfeier

金虫 (小有名气)
降低温度、降低诱导剂浓度以及换别的表达载体确实是不错的选择。若是还不可以的话那就尝试着蛋白复性，如果是你的目的只是拿到部分蛋白做表征之类的应该是足够了，你也可以选择尝试真核表达，有时也是可以实现可溶性表达的。
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8楼2012-04-06 15:18:16
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普通回帖

zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ningxi123456: 金币+2 2012-04-25 20:30:47
尝试低温诱导，降低蛋白的量可以有效抑制包涵体的形成
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-03-26 17:07:53
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ningxi123456

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by imyting at 2012-03-26 17:43:29:
我也遇到过这种情况，的确很难解决，我觉得可以从以下几点尝试：
1.降低温度，最容易想到的方法，文献中有很多都是这么做的，但是有时候效果并不是很明显，最多可降至8℃；
2.分析自己序列的疏水氨基酸含量，并 ...

我用过16度诱导14小时，没有诱导出来的呢
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4楼2012-03-26 19:04:15
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-06 12:09:20
ningxi123456: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-04-10 15:39:10
你的诱导温度有些高啊，我以前做用的是30度，有些蛋白表达就是这样的，全在包涵体里面，确实没有什么比较好的方法，建议你换个表达系统或者是做些结构改造增加蛋白的睡溶性
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7楼2012-04-06 11:05:23
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btx362237729

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ningxi123456: 金币+4 2012-04-25 20:31:26
降低温度  增加IPTG浓度 换载体
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人生最黑暗的时光终于过去了
9楼2012-04-06 18:39:03
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xiaogang0301

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你现在知道形成包涵体 可以给他进行超声破碎或者用尿素处理 然后在进行纯化 去尿素什么的都可以 这样做要保证你的蛋白表达量高
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做自己想做的
10楼2012-04-13 10:53:59
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