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ningxi123456金虫 (小有名气)
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原核表达形成了包涵体怎么办啊？
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我的目的基因是水稻中克隆出来的，连到PET24上做原核表达，表达出来了，大小也对，但是在纯化跑SDS-PAGE电泳后发现它在沉淀里面，形成了包涵体。该怎么办啊？原核表达我都做了半年了，现在形成了包涵体，更是郁闷，各位大侠，谁能帮我解决下啊，感激不尽~！！！ 我的目的蛋白大概38Da，按1:100加入500ml的LB培养基中摇菌至OD600=0.6，加入0.7mM的IPTG，37°C诱导三个小时。 |
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imyting
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【答案】应助回帖
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ningxi123456: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-03-26 19:04:56
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amisking: MolEPI+1, 鼓励新虫发帖交流！ 2012-03-26 19:55:26
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我也遇到过这种情况，的确很难解决，我觉得可以从以下几点尝试： 1.降低温度，最容易想到的方法，文献中有很多都是这么做的，但是有时候效果并不是很明显，最多可降至8℃； 2.分析自己序列的疏水氨基酸含量，并进行信号肽预测，必要时可将信号肽切除，因为一般来说信号肽中疏水氨基酸多，会影响蛋白质可溶； 3.可以做一个OD值的梯度，OD0.4-0.6是分子克隆提供的条件，很多文献也这么做，但是这个条件不适合溶解性低的蛋白，OD1.0时效果一般比较好，你可以试试别的OD值。 4.IPTG的浓度影响不太大，但是我试过将IPTG浓度降低十倍，一点儿也不影响效果，IPTG价格还是比较贵的，能省就省吧。 5.如果上述都不行，就只剩最后一种方法了，换载体，对于研究生来说周期应该也不长，毕竟都做过这个，例如PET-30a之类的。 |
3楼2012-03-26 17:43:29
panda73
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 恩，很热心哦 2012-03-27 11:17:18
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事实上，大部分外源蛋白在大肠杆菌中表达时都是形成包涵体（除非一些较小的，二硫键较少（1对）的）。 解决办法一般有三个： 1： 与一些助溶的蛋白融合表达：如：常用的GST，TrxA融合表达载体等 2：共表达一些伴侣类分子，如Dsb系列，等有大量文献报道，但不如1的效果好。 3.改变表达条件：如上所述，包括降低诱导强度（IPTG=0.1mM),降低诱导温度（12-16度）等，然后从裂菌上清中纯化可溶的部分，有时候，也能得到足够的可溶蛋白（如果你加了Histag方便纯化） 听起来，你们实验室的分子生物学不是强项，否则，可以很快将集中最常用的融合表达都试一遍。如果3还不行，则直接考虑做变性复性吧，还是可以得到一点可溶蛋白的 |
5楼2012-03-26 21:26:48
【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+5, 鼓励新虫积极应助交流哈 2012-04-06 10:07:45
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ningxi123456: 金币+2 2012-04-25 20:31:14
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ningxi123456: 金币+2 2012-04-25 20:31:14
| 在原核细胞中的表达，要受原核细胞基因表达的多级调控影响，如基因结构的调控。利用宿主菌的调控系统调节外源基因的表达，防止外源基因的表的产物对宿主菌毒害如包涵体。那既然是这样的原因，是不是可以做点什么让包涵体进行裂解呢？？然后包涵体裂解物经过透析复性后,应该可获得较高纯度的复性目的蛋白。至于如何裂解包涵体，应该去找一些文献，看看！ |
6楼2012-04-06 10:02:08
yanfeier
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