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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达 蛋白质全在沉淀里，这是怎么回事啊
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)

[求助] 原核表达 蛋白质全在沉淀里，这是怎么回事啊

最近在做原核表达，但是破碎细胞后，上清中什么也没有，只有沉淀里有貌似是目的条带的蛋白，如果是形成包涵体的话量应该是很大的吧，可是我的蛋白量很少，而且全都在沉淀里，实在不知道该怎么解释，求助啊…………
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1楼 2013-07-11 21:11:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kabuqinuo89(gyesang代发): 金币+3, 鼓励为虫子普及相关知识！ 2013-07-12 00:56:17
kabuqinuo89: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-12 09:53:04
重组蛋白质形成包涵体的机理：1.重组蛋白质的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键。2.外源基因合成太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键的正确配对，同时可能有太多的蛋白质间的非特异性结合、蛋白质局部浓度高于溶解度。3.重组蛋白质的一级结构也与包涵体的形成有关，一般说含硫氨基酸氨基酸多的蛋白质可能易于形成包涵体，含脯氨酸多的蛋白质则明显的与形成包涵体的概率呈正相关，可能是因为脯氨酸破坏螺旋结构，而螺旋结构多位于蛋白质分子表面，有相对较强的机械强度，能够抑制蛋白质分子之间的彼此靠近和相互作用。4.重组蛋白质所处的环境可能不适宜蛋白质形成天然构象，发酵温度较高和pH接近重组蛋白质的等电点时比较容易形成包涵体。

综上述，重组蛋白质形成包涵体不一定需要绝对的巨大的表达量。
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3楼2013-07-12 00:27:19
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2013-07-12 09:50:36
测定酶的活性，还有包涵体真的不是表达量多才形成的吗？我记得是温度高时，蛋白质合成太快，来不及正确折叠所以形成了包涵体，不是这样吗？...

1.不一定是表达量多才形成，具体参照凌波丽的，测酶的活性最好是可溶性，改变条件增加可溶性的表达量，
2.很多文章都是用包涵体做的，包括像PLANT CELL这样的杂志，如果你是看到文献上有这样做的，建议你发邮件问问作者，老外一般来说还是比较大度的，给的答案都很详细
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星陈代谢
7楼2013-07-12 10:27:08
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by kabuqinuo89 at 2013-07-12 10:27:18
我想再问下，如果培养基的PH为6.7，而我表达的重组蛋白质的pH为6.0-6.4左右，那么这个培养基的等电点算不算接近我重组蛋白质的等电点呢...

蛋白等电点1〉Iso-electric focusing，这个比较准确，不过需要大概了解你的等电点范围后选择不同的IEF stripe。2〉软件模拟，这个大多不靠铺...

原核表达遇到这种情况，像楼上说的，原因其实比较的复杂。给你的解决的建议
1. 你先确定你表达的基因来源。有些基因的表达，他的蛋白需要特殊的charporene来帮助折叠，而你的strain没有。你可以查一些文献关于你基因的文献。同时克隆那个相应的charporene，这样可以比较好的解决。有文献提到lipase用这个方法，极大提升活性。
2. 你的载体，表达的时候，尽量少的增加一些tag，虽然大多数时候是安全的，但仍有概率造成misfolding。
3. 表达的时候，选择合适的strain。同一类的strain，有很多的亚种，例如BL21。同时在做表达的时候，一个比较好用的方法就是诱导前30 min开始降温表达。不过需要你摸索一下条件了。
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9楼2013-07-12 11:20:29
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普通回帖

kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-12 00:55:09
kabuqinuo89: 金币+2 2013-07-12 09:50:49
包涵体的形成不一定是蛋白表达量高才聚集形成的，有可能蛋白本身性质决定了它就是疏水性的，你后续要做什么试验？
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kabuqinuo89
星陈代谢
2楼2013-07-11 22:27:12
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-12 00:27:19
重组蛋白质形成包涵体的机理：1.重组蛋白质的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键。2.外源基因合成太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键的正确配对，同时可能有太多的蛋白质间的非特异 ...

要是洗涤包涵体后，大规模复性难度还是很大的！
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海纳百川止于至善
4楼2013-07-12 08:05:02
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-07-11 22:27:12
包涵体的形成不一定是蛋白表达量高才聚集形成的，有可能蛋白本身性质决定了它就是疏水性的，你后续要做什么试验？

测定酶的活性，还有包涵体真的不是表达量多才形成的吗？我记得是温度高时，蛋白质合成太快，来不及正确折叠所以形成了包涵体，不是这样吗？
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5楼2013-07-12 09:50:36
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-12 00:27:19
重组蛋白质形成包涵体的机理：1.重组蛋白质的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键。2.外源基因合成太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键的正确配对，同时可能有太多的蛋白质间的非特异 ...

太帅了 O(∩_∩)O~  我再多做几次试验确定下吧
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6楼2013-07-12 09:54:03
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-12 00:27:19
重组蛋白质形成包涵体的机理：1.重组蛋白质的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键。2.外源基因合成太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键的正确配对，同时可能有太多的蛋白质间的非特异 ...

我想再问下，如果培养基的PH为6.7，而我表达的重组蛋白质的pH为6.0-6.4左右，那么这个培养基的等电点算不算接近我重组蛋白质的等电点呢
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8楼2013-07-12 10:27:18
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laoshi0633

木虫 (职业作家)
包涵体，需要变性复性
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学习是一种信仰
10楼2013-07-12 14:33:52
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