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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)


[求助] 蛋白质等电点沉淀之后怎么重新溶解

现在在做蛋白质纯化,想过阳离子交换柱,因为蛋白质稳定pH要>4.5,等电点预测在5.1左右,故选用pH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液,但加了之后就浑浊了,大侠们,我该怎么办
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流,共同进步~~ 2013-07-02 18:52:58
鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢,我再看看 2013-07-03 14:33:48
是否精确测算过蛋白等电点?因为你的蛋白稳定要>4.5,用4.6的缓冲液去置换,蛋白会先经过5.1的等电点沉淀,然后继续加会稍许变清,但是因为距离等电点较近,所以不会变的很清,就是说不一定会完全溶解。楼主需要考虑一下精确测量蛋白的等电点,然后选择合适的pH缓冲液。另外,层析类型也需要考虑,是否一定要用阳离子交换?
2楼2013-07-02 11:03:11
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流,共同进步~~ 2013-07-02 18:53:04
鸡鸣不已: 金币+20, ★★★很有帮助, 谢谢,我再看看 2013-07-03 14:34:01
我想问一下,你的蛋白是需要重新溶解,还是需要改进实验方法?

1. 如果是重新溶解,建议你变性溶解!选择尿素或者盐酸胍!
2.如果是改进实验方法,建议你先准确计算一下你的等电点,然后看看等电点是否很高?根据等电点做选择合适的离子柱!
长得比我英俊的,没我有才华!有才华的,没我长得俊!
3楼2013-07-02 12:26:39
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marmot218

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流,共同进步~~ 2013-07-02 18:53:19
鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢,我再看看 2013-07-03 14:34:21
首先等电点要准确 然后为什么不能用阴离子交换呢 如果用阴离子交换 缓冲液的选择会增加很多
4楼2013-07-02 13:36:40
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
4楼: Originally posted by marmot218 at 2013-07-02 13:36:40
首先等电点要准确 然后为什么不能用阴离子交换呢 如果用阴离子交换 缓冲液的选择会增加很多

我们是先用阴离子柱,再过阳离子柱。。。尝试过ni柱,发现不行
5楼2013-07-02 17:18:53
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
3楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-07-02 12:26:39
我想问一下,你的蛋白是需要重新溶解,还是需要改进实验方法?

1. 如果是重新溶解,建议你变性溶解!选择尿素或者盐酸胍!
2.如果是改进实验方法,建议你先准确计算一下你的等电点,然后看看等电点是否很高?根 ...

变性溶解,会使蛋白变性吗?谢谢
6楼2013-07-02 17:19:29
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2013-07-02 11:03:11
是否精确测算过蛋白等电点?因为你的蛋白稳定要>4.5,用4.6的缓冲液去置换,蛋白会先经过5.1的等电点沉淀,然后继续加会稍许变清,但是因为距离等电点较近,所以不会变的很清,就是说不一定会完全溶解。楼主需要考 ...

怎么准确测量等电点,我们是先过阴离子柱,再过SP阳离子柱,尝试过Ni柱,但行不通,谢谢
7楼2013-07-02 17:20:42
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-07-02 17:19:29
变性溶解,会使蛋白变性吗?谢谢...

会!然后需要renaturation!
长得比我英俊的,没我有才华!有才华的,没我长得俊!
8楼2013-07-02 19:53:48
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marmot218

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

可以尝试加一些表活、去污剂之类的 或者低浓度的变性剂 对有些蛋白有稳定作用
9楼2013-07-03 09:17:31
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

纯化还是不要乱加活性剂,会导致挂不上柱子,如果是先阴再阳的纯化方式,为何不试试先阴后疏水,这样就不涉及到缓冲液的pH问题,只需要调节离子强度,相对来说会比较容易。但是疏水洗脱会困难些,要选择好洗脱液的离子强度,或者干脆走梯度。
总之你的pH比较接近等电点,不好调啊。
10楼2013-07-03 11:03:23
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